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双萤光素酶报告基因检测系统~实验操作篇 2021-10-09

自1990年萤光素酶生物传感器技术诞生以来,单萤光素酶检测系统到双萤光素酶检测系统的发展,为科研人员提供了更为严谨的实验手段。双萤光素酶报告基因检测系统在单报告基因的基础上引入了“内参对照”报告基因,可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率带来的干扰,起到校正的作用,从而使实验结果更为可靠。今天小翌将从双萤光素酶报告基因检测系统的原理与应用开篇,给大家分享双萤光素酶报告基因检测系统的实验操作流程。


双萤光素酶报告基因检测系统原理


萤火虫萤光素酶是一种胞内蛋白,大小为61KDa。在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下,催化底物萤火虫萤光素氧化,生成氧化萤光素,并发出黄绿色光,其最强发光波长为560nm。

1632971048718863.jpg


海肾萤光素酶也是一种胞内蛋白,大小为36KDa。只需要氧气就可以催化腔肠素,氧化生成高能产物coelenteramide,并发出蓝光,其最强发光波长为465nm

海肾荧光素酶.jpg




双萤光素酶报告基因检测系统应用

◆ microRNA研究

在报告基因的3'端加上目的基因的3'UTR,就能用来检测miRNA对于目的基因的调控(抑制作用),报告基因表达越少,说明miRNA的作用就越强。

◆ 转录调控研究

在报告基因的5'端加上待检测基因的启动子,就可以用来检测转录因子对启动子的作用,启动转录越多,那报告基因的表达量就越大,荧光值越高。

◆ 启动子研究

将启动子区域序列进行分段截短,或对特定位点进行突变,再分别构建到luciferase报告载体中,检测其启动子活性。

◆ 信号通路研究

信号通路的激活/监测基因的表达水平。


......



双萤光素酶报告基因检测实验操作流程


报告基因检测流程主要有4个模块:分别是质粒构建、细胞转染、报告基因检测和数据分析。


质粒构建


双萤光素酶报告基因系统一般将萤火虫萤光素酶报告基因质粒和海肾萤光素酶报告基因质粒共转染细胞,或将这两个报告基因构建到同一个骨架质粒上(如pGL4质粒),分别用不同的启动子启动其表达。


◆ 主报告基因载体的选择

根据实验目的选择对应的载体骨架。

如果是基因调控研究,需要选择不带启动子或其他调控元件的骨架载体。如果研究启动子强弱或转录因子对启动子的作用,那么就在该萤光素酶的5'端加上待检测启动子序列或者有转录因子结合位点的启动子(下图左)。如果想检测miRNA对于目的基因的抑制作用,就可以在萤光素酶3'端加上目的基因的3'UTR(下图右)。


3'UTR-1.jpg

3'UTR-2.jpg


◆ 内参报告基因载体的选择

带有表达组成型启动子的萤光素酶表达载体作为内参。

不同的载体带有的启动子不同,通常启力:CMV>SV40>PGK>TK。通常内参基因表达的活性应当显著的高于背景组,同时,尽量小,确保不干扰主报告基因的表达。所以一般选择内参载体时,首先考虑活性较弱的TK启动子载体,如果表达量过低,再考虑其他类型的启动子或者构建自己需要特殊的启子。



细胞转染


◆ 转染细胞系选择

根据不同细胞系大小和生长速度选择初始密度(混合度在80-90%)。

◆ 转染方法选择

根据实验目的选择瞬时转染和稳定转染。对于短期表达的目的基因产物,可以选用瞬时转染法,操作更为简便。对于需要长期稳定表达目的基因产物,建议选用稳定转染法,稳定性更好。

◆ 转染报告基因比例

主报告基因:内参报告基因=10:1-100:1。

◆ 启动子和转录因子比例

启动子和转录因子比例一般为1:9。

◆ 核酸与转染试剂的比例

从1:2开始调整,另外,注意质粒的纯度、完整度和去内毒素。



报告基因检测


◆ 检测试剂选择

1633661054960541.jpg


◆ 检测板选择


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◆ 检测仪器选择


检测仪器:发光检测仪(Luminometer)或带有发光检测模块的多功能酶标仪。发光模式:化学发光(Luminescence)检测类别:终点法检测。波长范围:无需设置波长,如需选择,推荐全波长380-780 nm。
注:只选择在最大波长处检测发光,过滤掉其他发光信号,意味着检测会丢掉很多信号,丢失灵敏度。读取模式:底读或顶读。

检测时间:辉光型0.5-1 sec,闪光型2-10 sec。



数据分析


通过仪器可以直接读出萤火虫和海肾萤光素酶的数值,两种荧光值读数不少于4位数,读数大于8位数时,需要稀释裂解上清(读数与细胞种类、细胞状态、转染方法、转染时间等因素相关)。

相对表达倍数具体计算公式如下:

归一化值=萤火虫萤光素酶读值(主报告基因)/海肾萤光素酶读值(内参基因)

相对表达倍数=实验组归一化值/对照组归一化值

给大家举个例子:

分类

F-Luc

R-Luc

归一化(F/R)

平均值

相对表

倍数

对照组1

20118

50201

0.400748989

0.420043613

1

对照组2

18919

48091

0.393400012

对照组3

21910

47019

0.465981837

实验组1

60129

60911

0.987161596

1.226184349

2.919183

实验组2

87927

56873

1.546023596

实验组3

78791

68791

1.145367853

通过计算以上公式计算,实验组表达量是对照组的2.92倍。

写到这里,双萤光素酶报告基因检测系统的实验操作篇就给大家分享完了,大家对这个实验是否有更进一步的了解啦!如果您在实验操作过程中还有其他问题欢迎留言或来电咨询哦~

下期小翌将会结合大家的留言进一步分享~

最后小翌给大家分享一下Yeasen萤光素酶报告基因检测的解决方案,每一步都能帮到您!


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