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手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:如何正确选择逆转录引物? 2021-10-11

通过上期《手把手教你做出RT-qPCR最美曲线系列:逆转录酶,你真的了解吗?》一文的学习,相信大家对逆转录酶有了一定的了解,但选对了逆转录酶并不意味着你的逆转录实验就大功告成,逆转录引物的正确选择也是重要一环。根据不同实验目的,逆转录引物的选择也是大相径庭。接下来,小翌与大家一同学习下逆转录引物的相关知识,学会如何正确选择逆转录引物。


PART 01

逆转录引物介绍

1

Oligo(dT)

Oligo(dT)是多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸,就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链。因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合,所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端,因此,主要用于逆转带有Poly(A)尾的mRNA。例如模板为真核生物来源,Oligo(dT)可与mRNA的3’Poly(A)尾配对,有利于长链或全长mRNA的逆转录。但是,其对RNA样品的质量要求较高,不允许其降解,否则全长cDNA合成量会大量减少。

2

随机引物

随机引物是指当特定mRNA由于含有使逆转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体这一不特异的引物来拷贝全长mRNA,一般6到8个碱基,许多随机引物组成一套引物组。它可用于mRNA、rRNA、tRNA等各种RNA的逆转录,对于目标区域具有复杂二级结构/GC含量较高,或者来源为原核生物的模板也同样适应。

3

基因特异性引物

基因特异性引物(GSP)是某个基因序列的一部分,与模板互补的引物。该引物需要结合目标RNA的已知序列进行设计的。由于引物和RNA序列特异性结合,每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此,当分析多种目标时,则需要适用更多的RNA样本。通常特异性引物用于一步RT-qPCR实验中。


PART 02

逆转录引物优劣势比较



引物类型

结合部位

优点

缺点

Oligo(dT)

真核生物mRNA3’端poly(A)尾

可合成全长cDNA

1、仅扩增有polyA尾的mRNA

2、对模板质量要求高

随机引物

RNA的许多随机可结合部位

适合复杂结构和微量模板

特异性低,小片段多

基因特异性引物

特异性互补序列

特异性强,灵敏度高

仅合成特定的序列


PART 03

逆转录引物的选择


RNA类型:

1、真核生物mRNA

2、miRNA、核糖体RNA和tRNA等小RNA前体加A尾处理后的模板

引物选择:

Oligo(dT)

原因:

1、真核生物mRNA含有poly(A)尾,可以Oligo(dT)引物结合

2、miRNA、rRNA和tRNA本身无A尾,故需要人工处理后才能与Oligo(dT)引物结合



RNA类型:

1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等无3’端poly(A)尾的模板

2、长度比较长、有二级结构存在及微量样本的模板

引物选择:

随机引物

原因:

随机引物可以在任意位点和RNA结合并开始反转



RNA类型:

1、已知基因序列的模板

2、miRNA增加茎环结构的模板

引物选择:

基因特异性引物

原因:

1、针对特定序列设计的反转录引物

2、miRNA(茎环法)的反转录,需要根据基因序列设计对应的引物


:为提高反转录效率,并保障获得更加完整的cDNA,建议将Oligo(dT)和随机引物混合使用。



PART 04

精品推荐


为方便大家对逆转录引物的选择,翌圣生物通过基因工程技术开发出Hifair® III系列逆转录试剂盒,包括两种引物形式:单独成管的oligo(dT)、random primer和按比例预混的oligo(dT)、random primer。其中,按比例预混的引物仅适用与qPCR实验中。


RNA类型

引物选择

原因

1、真核生物mRNA

2miRNA、核糖体RNA和tRNA等小RNA前体加A尾处理后的模板

Oligo(dT)

1、真核生物mRNA含有poly(A)尾,可以Oligo(dT)引物结合

2miRNA、rRNA和tRNA本身无A尾,故需要人工处理后才能与Oligo(dT)引物结合

1、rRNA、tRNA、原核生物mRNA等无3’端poly(A)尾的模板

2、长度比较长、有二级结构存在及微量样本的模板

随机引物

随机引物可以在任意位点和RNA结合并开始反转。

1、已知基因序列的模板

2、miRNA增加茎环结构的模板

基因特异性引物

1、针对特定序列设计的反转录引物

2、miRNA(茎环法)的反转录,需要根据基因序列设计对应的引物


PART 05

Hifair® Ⅲ 系列逆转录酶性能展示

1

可耐受60℃反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录


图1. 以500 ng 293T细胞的总RNA为模板.jpg

图1. 以500 ng 293T细胞的总RNA为模板, 使用Hifair® Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES) 在42℃-65℃下进行逆转录。取1 μL cDNA为模板, 使用Hieff® Canace Gold 高保真酶 (Cat NO.10148ES)扩增TFRC基因(4.4kb)。M:1 kb DNA ladder.


2
优越的延伸性能,可合成19.8kbcDNA


图2 以500 ng 293T细胞的总RNA为模板.png

图2. 以500 ng 293T细胞的总RNA为模板,oligo dT为引物,使用Hifair®Ⅲ逆转录酶 (Cat NO.11139ES)合成cDNA。取1 μL cDNA为模板,使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)扩增DY1C1N1基因(19.9 kb)5’端的500 bp。M: 1 kb DNA ladder.


3

线性检测范围广,Total RNA 10 pg-5 μg


图3 以10 pg-5 μg的293T细胞的总RNA为模板.jpg

图3. 以10 pg-5 μg的293T细胞的总RNA为模板,使用Hifair®Ⅲ逆转录酶预混液 (Cat NO.11141ES)合成cDNA。取1 μL cDNA为模板,使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增PTTG1基因。


PART 06

相关产品


产品定位

产品名称

货号

单酶

Hifair®II Reverse Transcriptase

11110ES92/93

高灵敏度单酶

Hifair® III Reverse Transcriptase

11111ES92/93

Kit

Hifair®II 1st Strand cDNA Synthesis Kit

11119ES60

Kit(gDNA去除步骤)

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

11121ES60

高灵敏Kit(含gDNA去除步骤)

Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

11139ES60

预混液

Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix

11120ES60

预混液(含gDNA去除步骤)

Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11123ES60

高灵敏预混液(含gDNA去除步骤)

Hifair® III1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11141ES60



PART 07

翌圣逆转录产品已发表文献(部分)


[1] Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innateimmunity[J]. Cell, 2019, 177(4): 865-880. e21.IF31.398

[2] Fan H, Hong B, Luo Y, et al. The effect of whey protein on viral infection and replication of SARS-CoV-2and pangolin coronavirus in vitro[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2020, 5(1): 1-3. (IF13.493) 

[3] Wang J., et al., The mycobacterial phosphatase PtpA regulates the expression of host genes and promotescell proliferation[J]. Nat Commun. 2017 Aug 15;8(1):244.IF 12.353

[4] Zhou L, Hou B, Wang D, et al. Engineering Polymeric Prodrug Nanoplatform for Vaccinatio Immunotherapy of Cancer[J]. Nano Letters, 2020.IF12.279

[5] Xu L, Xu S, Sun L, et al. Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle[J]. Microbiome, 2021, 9(1). (IF 11.607)


以上是小翌本期给大家分享的内容,主要介绍了逆转录引物的种类、优缺点和选择应用。下期,我们将给大家分享逆转录实验中的一些注意事项,我们下期不见不散哦~

最后就是小翌发福利的时候啦,扫描以下二维码填写表单,即可免费申请逆转录系列产品试用装哦~

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