Dengan kemajuan terapi sel punca dan pengembangan obat berbasis organoid, matriks membran dasar memainkan peran penting sebagai nutrisi dan pembawa pendukung untuk kultur sel punca dan organoid, kultur sel 3D, dan aplikasi lain termasuk angiogenesis, eksperimen tumorigenesis in vivo, dll. Ekstrak membran dasar Ceturegel™ diekstraksi dari tumor tikus Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) yang kaya akan protein matriks ekstraseluler termasuk laminin, kolagen tipe IV, nestin, dll. IGF, FGF, dan faktor pertumbuhan lainnya. Pada suhu ruangan, matriks membran dasar Ceturegel™ berpolimerisasi untuk membentuk matriks tiga dimensi yang aktif secara biologis. Ia dapat mensimulasikan struktur, komposisi, sifat fisik, dan fungsi membran dasar sel secara in vivo, yang bermanfaat untuk kultur dan diferensiasi sel secara in vitro dan merupakan alternatif matrigel yang baik.

1. Apa itu matriks membran dasar Ceturegel™?
2. Apa peran matriks membran dasar Ceturegel™?
3. Apa karakteristik matriks membran dasar Ceturegel™?
4. Aplikasi populer matriks membran dasar Ceturegel™
5. Tanya Jawab Umum
6. Panduan pemilihan matriks membran dasar Ceturegel™ dari Yeasen

1. Apa itu matriks membran dasar Ceturegel™?

Matriks yang berdekatan dengan sel endotel, sel epitel, otot, dan sel saraf membentuk matriks ekstraseluler berlapis yang berkesinambungan yang disebut membran dasar. Membran dasar mengalami degenerasi dan regenerasi selama perkembangan dan penyembuhan luka. Membran dasar tidak hanya menyokong sel dan lapisan sel, tetapi juga berperan penting dalam pembentukan jaringan dengan memengaruhi adhesi sel, migrasi, proliferasi, dan diferensiasi, yang merupakan fungsi membran dasar. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa membran dasar merupakan penghalang utama terhadap invasi sel tumor metastasis.

Gambar 1. Matriks membran dasar Ceturegel™

Matriks membran dasar Ceturegel™ dikembangkan dan diproduksi oleh Yeasen tidak mengandung LDEV (Lactate Dehydrogenase Enhancing Virus) dan memiliki kandungan endotoksin yang sangat rendah. Dan setelah deteksi mikoplasma untuk memastikan tidak ada kontaminasi mikoplasma, termasuk berbagai jenis seperti konsentrasi dasar, konsentrasi tinggi, dan faktor pertumbuhan rendah.

2. Apa peran matriks membran dasar Ceturegel™?

Matriks membran dasar Ceturegel™ dapat digunakan untuk menyiapkan matriks membran dasar dengan berbagai persyaratan. Matriks ini dapat digunakan untuk studi pensinyalan sel, seperti studi tentang peran faktor pertumbuhan dalam pembentukan tubulus ginjal oleh sel punca ginjal tikus, studi ekspresi gen sel punca epitel mamae tikus, dan eksperimen invasi tumor Transwell. Pada saat yang sama, matrik ini dapat digunakan untuk studi morfologi sel, fungsi biokimia, migrasi, infeksi, dan ekspresi gen. Matriks membran dasar Ceturegel™ dapat secara efektif membantu perlekatan dan diferensiasi sel epitel dan jenis sel lainnya, termasuk sel saraf, sel punca, sel epitel mamalia, sel melanoma, sel endotel vaskular, sel tiroid, dan sel folikel rambut. Pada saat yang sama, matriks membran dasar Ceturegel™ juga memengaruhi tingkat ekspresi protein sel epitel mamae tikus dan mendukung regenerasi saraf perifer.

Gambar 2.Arah aplikasi utama matriks membran dasar Ceturegel™

Migrasi dan invasi sel secara terperinci: Migrasi sel, yang juga dikenal sebagai perayapan, pergerakan, atau pergerakan sel, mengacu pada pergerakan sel setelah menerima sinyal migrasi atau merasakan gradien zat tertentu. Migrasi sel adalah proses bergantian dari perpanjangan pseudopodia di kepala sel, pembentukan adhesi baru, dan penarikan ekor badan sel. Migrasi sel adalah salah satu fungsi dasar sel normal, dan juga merupakan proses fisiologis pertumbuhan dan perkembangan tubuh yang normal. Sebagai bentuk pergerakan sel hidup yang ada di mana-mana, ia dapat berpartisipasi dalam berbagai proses fisiologis dan patologis kolektif. Seperti perkembangan embrio, angiogenesis, penyembuhan luka, respons imun, respons inflamasi, aterosklerosis, metastasis kanker, dll. Sedangkan, invasi sel mengacu pada kemampuan sel untuk bermigrasi dari satu area ke area lain melalui matriks ekstraseluler. Invasi sel adalah respons sel normal dan sel kanker terhadap rangsangan kimia dan mekanis. Invasi sel sering terjadi dalam proses penyembuhan luka, angiogenesis, inflamasi, metastasis sel tumor, dan infiltrasi jaringan yang abnormal.

3. Apa karakteristik matriks membran dasar Ceturegel™?

Keamanan tinggi: tidak ada LDEV (virus peningkatan dehidrogenase laktat)
Keanekaragaman konsentrasi: kisaran konsentrasi antara 8~20 mg/ml
Stabilitas batch yang baik: proses pemeriksaan kualitas produksi yang ketat untuk memastikan kinerja yang stabil antar batch
Endotoksin rendah: kandungan endotoksin <8 EU/ml
Deteksi kontaminasi: tidak terdeteksi adanya residu mikoplasma, bakteri, dan jamur
Output batch tunggal yang tinggi: Output batch tunggal berada di atas level 50L
Kesesuaian: Kompatibel dengan semua jenis media kultur sel

4. Aplikasi populer matriks membran dasar Ceturegel™

4.1 Uji migrasi dan invasi

Metode eksperimen untuk mendeteksi kemampuan migrasi dan invasi sel adalah eksperimen Transwell, dan Transwell juga disebut eksperimen perforasi. Suspensi sel ditambahkan ke dalam bilik terlebih dahulu karena bilik tersebut memiliki pori-pori yang rapat. Bilik-bilik tersebut kemudian ditempatkan dalam pelat 24-sumur yang telah ditambahkan medium lengkap. Sel-sel mengalami deformasi dan melewati lubang-lubang di bilik tersebut ke bagian luar bilik yang lebih kaya nutrisi, tempat sel-sel tersebut menempel di bagian luar. Dengan pewarnaan dan penghitungan sel-sel di luar bilik, kemampuan migrasi dan invasi sel-sel dapat dinilai. Prinsip Transwell adalah menempatkan bilik kecil di dalam pelat kultur, bilik kecil tersebut disebut bilik atas, dan pelat kultur tersebut disebut bilik bawah. Lapisan atas dan bawah cairan kultur dipisahkan oleh membran polikarbonat, lapisan atas cairan kultur ditambahkan ke bilik atas, dan lapisan bawah cairan kultur ditambahkan ke bilik bawah. Sel-sel berada di bilik atas, dan komposisi medium bawah akan memengaruhi sel-sel di bilik atas karena permeabilitas membran. Selanjutnya, efek komponen dalam medium bawah terhadap pertumbuhan dan pergerakan sel diselidiki.
Operasi spesifik matriks membran dasar Ceturegel™ dalam uji migrasi dan invasi: Matriks membran dasar Ceturegel™ yang diencerkan ditambahkan ke ruang atas Transwell, dan sel-sel ditanam dan diinkubasi dalam suhu 37°C, 5% CO₂ inkubator selama 24 jam, difiksasi dalam 4% paraformaldehid, dan diwarnai dengan larutan pewarna kristal violet 0,1%. Sel diamati dan dihitung di bawah mikroskop kontras fase terbalik.

Gambar 3. Hasil pewarnaan kristal violet setelah invasi sel

4.2 Angiogenesis

1) Sehari sebelum percobaan, keluarkan Ceturegel™ Matrigel dari freezer dan simpan dalam lemari es 4°C semalaman agar mencair sembari mendinginkan bahan habis pakai.
2) Selalu simpan Ceturegel™ Matrigel dalam kotak es sebelum percobaan. Buka kemasan steril dari slide angiogenik dan keluarkan slide.
3) Tambahkan 10 μl Ceturegel™ Matrigel ke setiap lubang. Perhatikan bahwa ujung pipet harus tegak lurus dengan bagian atas lubang bagian dalam saat menambahkan Ceturegel™ Matrigel untuk mencegah Matrigel mengalir melalui lubang bagian atas dan meninggalkan residu lem.
4) Pertama-tama tutup slide, siapkan cawan petri 10 cm, dan letakkan tisu yang dibasahi air untuk membuat kotak basah.
5) Masukkan slide ke dalam cawan petri dan tutup cawan petri. Masukkan ke dalam tabung reaksi CO₂ inkubator, diamkan selama sekitar 30 menit, tunggu gel menggumpal, dan siapkan suspensi sel pada saat yang bersamaan.
6) Siapkan sel yang telah dicerna menjadi suspensi sel dengan kepadatan 2*10⁵ sel/ml dan aduk hingga rata.
7) Keluarkan slide kaca yang berisi pembuluh darah yang telah mengeras menjadi gel. Tambahkan 50 μl suspensi sel ke setiap sumur, pastikan ujung pipet tetap vertikal di atas sumur atas dan tidak menyentuh gel di sumur bawah.
8) Tambahkan media kultur sel, tutup wadah, dan diamkan. Setelah beberapa saat, semua sel akan tenggelam ke permukaan Matrigel.

Gambar 4. Grafik hasil angiogenesis

Pewarnaan imunofluoresensi

1) Keluarkan media dari sumur dengan hati-hati tanpa menyentuh lem atau jaringan sel. Encerkan kalsein dalam media bebas serum hingga konsentrasi akhir 6–8 µg/ml. Tambahkan larutan pewarna sel untuk merendam sel sepenuhnya, dan inkubasi pada suhu ruangan selama 30-40 menit dalam gelap.
2) Cuci tiga kali dengan PBS. Perhatikan bahwa PBS harus ditambahkan perlahan ke sumur atas untuk menghindari dampak pada sel. Pengamatan fluoresensi menggunakan panjang gelombang Ex=485 nm, Em=529 nm

Gambar 5. Pewarnaan imunofluoresensi pembuluh darah

4.3 Kultur sel 3D

Tidak seperti kultur sel tradisional, kultur sel 3D mereproduksi lingkungan sel in vivo. Bahkan model sferoid sederhana dapat mengimbangi kekurangan kultur monolayer. Struktur ini dapat membentuk gradien oksigen, nutrisi, metabolit, dan sinyal terlarut, yang pada gilirannya membentuk populasi sel yang beragam. Teknologi kultur sel 3D dapat mensimulasikan lingkungan alami tempat sel hidup dalam organisme dengan lebih baik, sehingga interaksi antara sel dan respons biokimia dan fisiologis menjadi lebih realistis. Dalam lingkungan 3D, respons sel terhadap rangsangan endogen dan eksogen lebih mirip dengan respons in vivo mereka.
Cara kerja khusus matriks membran dasar Ceturegel™ dalam kultur sel 3D adalah sebagai berikut: Campur perlahan matriks membran dasar Ceturegel™ dengan konsentrasi suspensi sel tunggal HepG2 yang telah disesuaikan 1:1, lalu tambahkan 50 μl suspensi sel tunggal yang telah dicampur di atas ke dalam pelat 24 sumur yang telah didinginkan terlebih dahulu dengan ujung pipet yang telah didinginkan terlebih dahulu untuk membentuk Tetesan sel berbentuk lengkung yang dikultur dalam inkubator 37°C, 5% CO2, diamati dan difoto setiap hari.

Gambar 6. Hasil kultur sel 3D

Tabel 1. Matriks membran dasar kultur sel 3D Ceturegel™ Referensi penggunaan:

Catatan: Berbagai batch matriks membran dasar Ceturegel™ memiliki perbedaan konsentrasi tertentu, dosis yang disarankan hanya untuk referensi

4.4 Percobaan pembentukan tumor in vivo

Mengambil contoh percobaan tumorigenesis subkutan sel HepG2 pada tikus telanjang, matriks membran dasar Ceturegel™ dan suspensi sel digunakan untuk pengenceran 1:1, dan tikus betina BALB/c-nu berusia 4-5 minggu diinokulasi secara subkutan. Proses percobaannya adalah sebagai berikut:
♦ Siapkan sel HepG2 dengan pertumbuhan logaritmik dan kepadatan sel sekitar 80-90%, dan ganti media segar pada malam sebelum mengumpulkan sel.
♦ Sel-sel dicerna oleh tripsin. Ketika sel-sel menjadi bulat dan tidak meninggalkan cawan kultur, tripsin dikeluarkan, medium bebas serum ditambahkan untuk membuat suspensi sel, disentrifugasi dan dibersihkan sekali, dan konsentrasi akhir adalah 5 × 10⁷ sel/mL.
♦ Encerkan suspensi sel dan matriks membran dasar Ceturegel™ dalam rasio 1:1 pada suhu 4 ℃ untuk menyiapkan konsentrasi akhir 5 × 10⁷ sel/mL.
♦ Ambil tikus telanjang yang sudah difiksasi dengan tangan kiri, lalu suntikkan secara subkutan di bahu kanan tikus telanjang. Selama inokulasi, jarum dimasukkan secara subkutan sedikit lebih dalam, sekitar 1 cm, untuk mengurangi luapan suspensi sel dari lubang jarum setelah injeksi.
Volume inokulasi adalah 200 μ L。 (Proses ini harus diselesaikan dalam waktu setengah jam sejauh mungkin. Dalam perjalanan, suspensi sel harus diletakkan di atas es untuk memperlambat apoptosis sel dan mencegah fenomena gel).
♦ Masukkan kembali tikus telanjang ke dalam kandang untuk melanjutkan makan, dan tumor dapat terlihat selama sekitar 1 minggu hingga 1 bulan.Berdasarkan rancangan percobaan, eutanasia tikus telanjang ketika volume tumor memenuhi persyaratan, dan ambil fotonya.

Catatan: Kelompok kontrol adalah suspensi media kultur dan sel, dan kepadatan akhir sama dengan kelompok uji lem matriks.

4.5 Kultur organoid

Organoid adalah jaringan kecil multiseluler 3D yang dibedakan dari sel punca. Beberapa sifat organ dapat direproduksi. Organoid bersifat multiseluler dan menunjukkan tingkat perakitan diri yang tinggi, dan karenanya lebih mampu menunjukkan respons dan interaksi seluler in vivo yang kompleks daripada kultur 2D tradisional. Sel punca dan/atau sel progenitor organ dari jaringan normal atau yang sakit dapat dicampur dengan matriks membran dasar Ceturegel™ atau kolagen. Membentuk ginjal, tiroid, hati, otak, paru-paru, usus, prostat, dan mikroorganisme lainnya. Misalnya, bagi para peneliti yang melakukan penyaringan genetik, substrat matriks membran dasar Ceturegel™ dapat digunakan sebagai biotinta untuk memungkinkan pelokalan dan penyisipan sel/organoid hidup yang tepat dalam bioprinting 3D.

Gambar 7. Proses operasi organoid

Konstruksi Organoid Usus Kecil Tikus

Persiapan sampel: Tikus dibunuh dengan cara disayat lehernya, dan permukaannya disemprot dengan alkohol untuk sterilisasi. Potong jaringan usus 3~15cm di dekat ujung lambung di bawah lingkungan yang steril, keluarkan mesenterium dan lemak di luar saluran usus dengan hati-hati menggunakan pinset, dan masukkan ke dalam larutan DPBS yang mengandung 1% antibodi ganda yang didinginkan terlebih dahulu pada suhu 4 ℃.

Pembersihan sampel: gunakan jarum suntik untuk membilas saluran usus 2-3 kali, gunakan gunting bedah untuk memotong saluran usus dengan hati-hati dengan rongga usus menghadap ke atas, dan gunakan pisau bedah untuk mengikis perlahan vili usus di permukaan rongga usus, dan setelah vili usus terkikis (menunjukkan jaringan transparan), letakkan jaringan usus dalam cawan kultur baru yang berisi DPBS selama 2-3 kali.

Penanganan awal sampel: potong jaringan usus halus yang telah dicuci menjadi potongan-potongan kecil selebar 2 mm, lalu pindahkan ke tabung sentrifus 50 ml yang baru. Cuci dengan lembut 3-5 kali dengan DPBS untuk membuang sel-sel vili usus dan jaringan lemak yang mengapung.

Pencernaan sampel: tambahkan 10-15 ml DPBS yang telah didinginkan sebelumnya yang mengandung 3-5 mM EDTA ke dalam fragmen usus halus yang telah dibersihkan untuk pencernaan, inkubasi pada suhu 4 ℃ selama sekitar 30 menit, dan kocok tabung sentrifus perlahan setiap 10 menit selama periode ini.

Setelah pencernaan, buang supernatan larutan pencernaan EDTA dan bilas jaringan secara perlahan dengan larutan penyangga DPBS baru 2-3 kali untuk menghilangkan sisa EDTA.

Tambahkan 10-15 ml DPBS yang telah didinginkan sebelumnya yang mengandung 0,1% BSA ke dalam fragmen jaringan usus halus, tiup dan suspensikan kembali fragmen jaringan berulang kali untuk memisahkan reses dari lapisan basal, lalu ambil sedikit suspensi untuk pemeriksaan mikroskopis. Jika sejumlah besar struktur seperti reses terlihat, hentikan peniupan, dan gunakan 70% untuk suspensi jaringan yang ditiup. Saringan penyaring μM untuk menyaring dan mengumpulkan suspensi jaringan yang melewati saringan penyaring.

Ulangi langkah 5-6 dua kali dan sentrifus pada kecepatan 1500rpm dan 4 ℃ selama 3 menit.

Pembentukan campuran: Ceturegel™ Matrix glue heavy suspension recess tissueprecision, setiap 10 μL matrix glue suspension mengandung 200~600 recess. Setelah resuspensi, campuran tersebut ditempatkan di atas es dan dioperasikan sesegera mungkin untuk menghindari pembentukan gel matrix glue.
Catatan: rasio pengenceran lem matriks ≥ 50% untuk memastikan stabilitas struktur perekat matriks Ceturegel™ dalam proses kultur.

Tanam suspensi campuran di tengah bagian bawah pelat 24 sumur, 30~50μL per sumur kiri dan kanan untuk menghindari suspensi bersentuhan dengan dinding samping pelat lubang.

Tempatkan pelat kultur yang dibudidayakan dalam inkubator suhu konstan karbon dioksida 37℃, dan inkubasi selama sekitar 30 menit hingga gel matriks mengeras.

Tunggu Ceturegel™ Setelah lem matriks benar-benar mengeras, tambahkan perlahan media kultur organ usus yang telah disiapkan di sepanjang dinding, 800μL per sumur.

Masukkan pelat 24-well ke dalam inkubator karbon dioksida 37 ℃ untuk kultur. Ganti media segar setiap 3 hari dan pantau status pertumbuhan organ seperti organ. Umumnya, organ seperti usus halus tikus terbentuk dalam waktu 5-7 hari.

Gambar 8. Hasil kultur in vitro organ mirip usus halus tikus

5. Tanya Jawab Umum

1. Apa alasan perbedaan warna (kuning muda hingga merah tua) dari substrat yang diperoleh?
Untuk matriks membran dasar Ceturegel™ yang mengandung fenol merah, hal ini terutama disebabkan oleh interaksi fenol merah dan bikarbonat dengan CO₂, tetapi perbedaan warna akan berkurang setelah diseimbangkan dengan 5% CO₂Setelah dibekukan dan dicairkan, kocok botol dengan perlahan untuk menyebarkan matriks membran dasar Ceturegel™ secara merata.
2. Hal-hal apa saja yang perlu diperhatikan dalam pengoperasian matriks membran dasar Ceturegel™?
Semua operasi harus dilakukan dalam lingkungan yang steril, dan pipet yang telah didinginkan harus digunakan untuk memastikan bahwa matriks membran dasar Ceturegel™ terhomogenasi.
3. Bagaimana cara membekukan dan menyimpan matriks membran dasar Ceturegel™ untuk digunakan?
Matriks membran dasar Ceturegel™ yang dibekukan dan dicairkan LDEV-Free dapat didistribusikan dalam beberapa tabung kecil. Semua distribusi harus dalam kriovial yang telah didinginkan sebelumnya, yang harus segera dibekukan dan disimpan untuk menghindari pembekuan dan pencairan berulang kali. Semua barang yang terlibat harus didinginkan terlebih dahulu sebelum digunakan. Gunakan pipet, ujung pipet, dan tabung kecil yang telah didinginkan sebelumnya untuk menangani matriks membran dasar Ceturegel™.

6. Panduan pemilihan matriks membran dasar Ceturegel™ dari Yeasen

Berbagai jenis matriks membran dasar Ceturegel™ memiliki aplikasi yang berbeda. Konsentrasi standar matriks membran dasar Ceturegel™ dapat digunakan untuk kultur sel polar, seperti sel epitel. Matriks ini dapat meningkatkan diferensiasi berbagai sel dan digunakan untuk eksperimen migrasi dan invasi sel tumor. Konsentrasi tinggi matriks membran dasar Ceturegel™ digunakan secara luas secara in vivo dan dapat digunakan untuk eksperimen pembentukan tubulus. Fungsi utama faktor pertumbuhan rendah (GFR) adalah untuk menghilangkan gangguan faktor pertumbuhan dalam eksperimen, dan cocok untuk penelitian dengan persyaratan tinggi untuk persiapan membran dasar. Matriks membran dasar Ceturegel™ tanpa fenol merah dapat menghilangkan gangguan indikator fenol merah dan cocok untuk eksperimen pengembangan warna, seperti kolorimetri dan deteksi fluoresensi. Matriks membran dasar Ceturegel™ tingkat kultur sel punca embrionik manusia secara khusus digunakan untuk kultur sel punca embrionik manusia, kultur sel punca bebas pengumpan pluripoten yang diinduksi. Yeasen menyediakan banyak jenis matriks membran dasar Ceturegel™, Anda dapat memilihnya berdasarkan percobaan Anda.

Tabel 2. Panduan Pemilihan Matriks Ceturegel™

Tipe produk	Kucing No.	Nama Produk	Matrigel Kucing No.	Arah aplikasi
Konsentrasi dasar (8-12 mg/ml)	40183ES	Matriks Ceturegel™ Bebas LDEV	356234/ 354234	Beradaptasi dengan eksperimen kultur, invasi, dan migrasi 2D dan 3D, dan juga dapat digunakan untuk eksperimen tumorigenik in vivo
	40184ES	Ceturegel™Matrix Bebas Phenol Red, Bebas LDEV	356237	Terutama digunakan untuk deteksi warna seperti eksperimen deteksi fluoresensi, dll.
Pengurangan faktor pertumbuhan	40185ES	Ceturegel™Matrix GFR, Bebas LDEV	354230	Terutama untuk menyingkirkan gangguan faktor pertumbuhan pada percobaan. Diterapkan pada penelitian terkait faktor pertumbuhan, jalur pensinyalan, dll.
	40186ES	Ceturegel™Matrix GFR, Bebas Phenol Red, Bebas LDEV	356231
Konsentrasi tinggi (≥18mg/ml)	40187ES	Ceturegel™Matrix Konsentrasi Tinggi, Bebas LDEV	354248	Terutama digunakan dalam percobaan seperti angiogenesis, embolisasi gel, dan pembentukan tumor in vivo (untuk angiogenesis, disarankan agar konsentrasi akhir matriks membran dasar Ceturegel™ harus ≥10mg/ml)
	40189ES (pertanyaan)	Matriks Ceturegel™ Konsentrasi Tinggi, GFR, Bebas LDEV	354263
	40188ES	Matriks Ceturegel™ Konsentrasi Tinggi, Bebas Phenol Red, Bebas LDEV	354262
Untuk sel induk	40190ES	Matriks Ceturegel™Berkualifikasi hESC, Bebas LDEV	354277	Terutama digunakan untuk kultur sel induk seperti hESC, iPSC, dll.
Spesifik organoid	40191ES (pertanyaan)	Matriks Ceturegel™ untuk kultur organoid, Bebas Phenol Red, Bebas LDEV	356255	Matriks membran dasar Ceturegel™ untuk Kultur Organoid