ด้วยความก้าวหน้าของการบำบัดด้วยเซลล์ต้นกำเนิดและการพัฒนายาที่ใช้ organoids เมทริกซ์ของเยื่อฐานจึงมีบทบาทสำคัญในการเป็นสารอาหารและตัวพาสำหรับเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดและ organoids การเพาะเลี้ยงเซลล์ 3 มิติ และการใช้งานอื่นๆ รวมทั้งการสร้างหลอดเลือดใหม่ การทดลองสร้างเนื้องอกในร่างกาย เป็นต้น สารสกัดจากเยื่อฐาน Ceturegel™ สกัดมาจากเนื้องอกของหนู Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ที่อุดมไปด้วยโปรตีนของเมทริกซ์นอกเซลล์ เช่น ลามินิน คอลลาเจนชนิดที่ 4 เนสติน เป็นต้น IGF, FGF และปัจจัยการเจริญเติบโตอื่นๆ ที่อุณหภูมิห้อง เมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ จะเกิดการพอลิเมอร์เพื่อสร้างเมทริกซ์สามมิติที่ทำงานทางชีวภาพได้ เมทริกซ์นี้สามารถจำลองโครงสร้าง องค์ประกอบ คุณสมบัติทางกายภาพ และหน้าที่ของเยื่อฐานเซลล์ในร่างกาย ซึ่งเป็นประโยชน์ต่อการเพาะเลี้ยงและการแบ่งตัวของเซลล์ในหลอดทดลอง และเป็นทางเลือกที่ดีของเมทริกซ์เจล

1. เมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ คืออะไร?
2. เมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ มีบทบาทอะไร?
3. เมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ มีลักษณะเฉพาะอะไรบ้าง?
4. การใช้งานเมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ ที่ได้รับความนิยม
5. คำถามที่พบบ่อย
6. คำแนะนำในการเลือกเมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ จาก Yeasen

1. เมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ คืออะไร?

เมทริกซ์ที่อยู่ติดกับเซลล์เยื่อบุผิว เซลล์เยื่อบุผิว เซลล์กล้ามเนื้อ และเซลล์ประสาท จะสร้างเมทริกซ์นอกเซลล์แบบต่อเนื่องเป็นชั้นๆ เรียกว่าเยื่อฐาน เยื่อฐานจะเสื่อมสภาพและสร้างใหม่ในระหว่างการพัฒนาและการสมานแผล เยื่อฐานไม่เพียงแต่ช่วยรองรับเซลล์และชั้นเซลล์เท่านั้น แต่ยังมีบทบาทสำคัญในการสร้างเนื้อเยื่อโดยส่งผลต่อการยึดเกาะของเซลล์ การอพยพ การแพร่กระจาย และการแบ่งตัว ซึ่งเป็นหน้าที่ของเยื่อฐาน ดังนั้นจึงกล่าวได้ว่าเยื่อฐานเป็นอุปสรรคหลักต่อการบุกรุกของเซลล์เนื้องอกที่แพร่กระจาย

รูปที่ 1 เมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™

เมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ ได้รับการพัฒนาและผลิตโดย Yeasen ไม่ประกอบด้วย LDEV (Lactate Dehydrogenase Enhancing Virus) และมีปริมาณเอนโดทอกซินต่ำเป็นพิเศษ และหลังจากตรวจพบไมโคพลาสมาแล้ว เพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีการปนเปื้อนของไมโคพลาสมา รวมถึงประเภทต่างๆ เช่น ความเข้มข้นที่เป็นเบส ความเข้มข้นสูง และปัจจัยการเจริญเติบโตต่ำ

2. เมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ มีบทบาทอะไร?

เมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ สามารถนำมาใช้ในการเตรียมเมทริกซ์เยื่อฐานสำหรับความต้องการต่างๆ ได้ สามารถใช้สำหรับการศึกษาการส่งสัญญาณของเซลล์ เช่น การศึกษาบทบาทของปัจจัยการเจริญเติบโตในการก่อตัวของท่อไตโดยเซลล์ต้นกำเนิดไตของหนู การศึกษาการแสดงออกของยีนของเซลล์ต้นกำเนิดเยื่อบุผิวเต้านมของหนู และการทดลองการรุกรานของเนื้องอกของ Transwell ในเวลาเดียวกัน สามารถใช้สำหรับการศึกษาสัณฐานวิทยาของเซลล์ การทำงานทางชีวเคมี การอพยพ การติดเชื้อ และการแสดงออกของยีน เมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ สามารถช่วยยึดเกาะและแยกความแตกต่างของเซลล์เยื่อบุผิวและเซลล์ประเภทอื่นๆ ได้อย่างมีประสิทธิภาพ รวมทั้งเซลล์ประสาท เซลล์ต้นกำเนิด เซลล์เยื่อบุผิวของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เซลล์มะเร็งผิวหนัง เซลล์เยื่อบุหลอดเลือด เซลล์ต่อมไทรอยด์ และเซลล์รูขุมขน ในเวลาเดียวกัน เมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ ยังส่งผลต่อระดับการแสดงออกของโปรตีนของเซลล์เยื่อบุผิวเต้านมของหนูและสนับสนุนการสร้างเส้นประสาทส่วนปลายใหม่

รูปที่ 2.ทิศทางการใช้งานหลักของเมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™

การอพยพของเซลล์และการบุกรุกโดยละเอียด: การอพยพของเซลล์ ซึ่งเรียกอีกอย่างว่า การคลานของเซลล์ การเคลื่อนที่ หรือการเคลื่อนที่ หมายถึงการเคลื่อนที่ของเซลล์หลังจากได้รับสัญญาณการอพยพหรือสัมผัสถึงการไล่ระดับของสารบางชนิด การอพยพของเซลล์เป็นกระบวนการสลับกันของการขยายของซูโดโพเดียในส่วนหัวของเซลล์ การสร้างการยึดเกาะใหม่ และการหดตัวของหางของตัวเซลล์ การอพยพของเซลล์เป็นหนึ่งในหน้าที่พื้นฐานของเซลล์ปกติ และยังเป็นกระบวนการทางสรีรวิทยาของการเจริญเติบโตและการพัฒนาตามปกติของร่างกายอีกด้วย เนื่องจากเป็นรูปแบบการเคลื่อนย้ายของเซลล์ที่มีชีวิตอยู่ทั่วไป จึงสามารถมีส่วนร่วมในกระบวนการทางสรีรวิทยาและพยาธิวิทยาต่างๆ ร่วมกันได้ เช่น การพัฒนาของตัวอ่อน การสร้างหลอดเลือดใหม่ การสมานแผล การตอบสนองของภูมิคุ้มกัน การตอบสนองของการอักเสบ หลอดเลือดแดงแข็ง การแพร่กระจายของมะเร็ง เป็นต้น ในขณะที่การบุกรุกของเซลล์หมายถึงความสามารถของเซลล์ในการอพยพจากบริเวณหนึ่งไปยังอีกบริเวณหนึ่งผ่านเมทริกซ์นอกเซลล์ การบุกรุกของเซลล์คือการตอบสนองของเซลล์ปกติและเซลล์มะเร็งต่อสิ่งกระตุ้นทางเคมีและทางกล การบุกรุกของเซลล์มักเกิดขึ้นในกระบวนการรักษาแผล การสร้างหลอดเลือดใหม่ การอักเสบ การแพร่กระจายของเซลล์เนื้องอก และการแทรกซึมของเนื้อเยื่อที่ผิดปกติ

3. เมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ มีลักษณะเฉพาะอะไรบ้าง?

ความปลอดภัยสูง: ไม่มี LDEV (แลคเตทดีไฮโดรจีเนสเพิ่มไวรัส)
ความหลากหลายของความเข้มข้น:ช่วงความเข้มข้นอยู่ระหว่าง 8~20 มก./มล.
เสถียรภาพแบตช์ที่ดี:กระบวนการตรวจสอบคุณภาพการผลิตที่เข้มงวดเพื่อให้มั่นใจถึงประสิทธิภาพการทำงานที่มั่นคงระหว่างชุดการผลิต
เอนโดทอกซินต่ำ: ปริมาณเอนโดทอกซิน < 8 EU/มล.
การตรวจจับการปนเปื้อน: ไม่พบสารตกค้างของไมโคพลาสมา แบคทีเรีย และเชื้อรา
เอาท์พุตแบบแบตช์เดียวสูง:เอาต์พุตแบบแบตช์เดี่ยวอยู่เหนือระดับ 50L
ความเข้ากันได้: ใช้ได้กับอาหารเลี้ยงเซลล์ทุกประเภท

4. การใช้งานเมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ ที่ได้รับความนิยม

4.1 การทดสอบการอพยพและการรุกราน

วิธีการทดลองเพื่อตรวจจับความสามารถในการเคลื่อนที่และการบุกรุกของเซลล์คือการทดลอง Transwell และ Transwell เรียกอีกอย่างว่าการทดลองแบบเจาะทะลุ ก่อนอื่นให้เติมเซลล์ที่แขวนลอยลงในห้องเนื่องจากห้องมีรูพรุนหนาแน่น จากนั้นจึงวางห้องลงในแผ่น 24 หลุมซึ่งเติมตัวกลางที่สมบูรณ์ลงไป เซลล์จะเสียรูปและผ่านรูในห้องไปยังด้านนอกของห้องที่มีสารอาหารมากขึ้น ซึ่งเซลล์จะติดอยู่ด้านนอก การย้อมสีและการนับเซลล์ภายนอกห้องสามารถตัดสินความสามารถในการเคลื่อนที่และการบุกรุกของเซลล์ได้ หลักการของ Transwell คือการวางห้องเล็กไว้ในแผ่นเพาะเลี้ยง ห้องเล็กเรียกว่าห้องบน และแผ่นเพาะเลี้ยงเรียกว่าห้องล่าง ชั้นบนและล่างของของเหลวเพาะเลี้ยงจะแยกจากกันด้วยเมมเบรนโพลีคาร์บอเนต ชั้นบนของของเหลวเพาะเลี้ยงจะถูกเติมลงในห้องบน และชั้นล่างของของเหลวเพาะเลี้ยงจะถูกเติมลงในห้องล่าง เซลล์อยู่ในห้องบน และองค์ประกอบของตัวกลางด้านล่างจะส่งผลต่อเซลล์ในห้องบนเนื่องจากความสามารถในการซึมผ่านของเมมเบรน นอกจากนี้ ยังมีการศึกษาผลกระทบของส่วนประกอบในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีอุณหภูมิต่ำกว่าต่อการเจริญเติบโตและการเคลื่อนที่ของเซลล์
การทำงานเฉพาะของเมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ ในการทดสอบการอพยพและการบุกรุก: เมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ ที่เจือจางถูกเติมลงในห้องด้านบนของ Transwell และเซลล์ได้รับการเพาะและฟักใน 37°C, CO 5%₂ ฟักเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตรึงในพาราฟอร์มาลดีไฮด์ 4% และย้อมด้วยสารละลายคริสตัลไวโอเล็ต 0.1% สังเกตและนับเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟสกลับด้าน

รูปที่ 3 ผลการย้อมคริสตัลไวโอเล็ตหลังจากการบุกรุกเซลล์

4.2 การสร้างหลอดเลือดใหม่

1) หนึ่งวันก่อนการทดลอง ให้นำ Ceturegel™ ออกมา นำ Matrigel ออกจากช่องแช่แข็งแล้ววางไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 4°C ข้ามคืนเพื่อให้ละลายน้ำแข็งในขณะที่ทำการทำให้วัสดุสิ้นเปลืองที่ใช้แล้วเย็นลงล่วงหน้า
2) ควรเก็บ Ceturegel™ Matrigel ไว้ในกล่องน้ำแข็งก่อนทำการทดลองเสมอ เปิดบรรจุภัณฑ์ที่ปลอดเชื้อของสไลด์สร้างหลอดเลือดและนำสไลด์ออก
3) เติม Ceturegel™ Matrigel 10 μl ลงในแต่ละหลุม โปรดทราบว่าปลายปิเปตควรตั้งฉากกับด้านบนของรูด้านในเมื่อเติม Ceturegel™ Matrigel เพื่อป้องกันไม่ให้ Matrigel ไหลผ่านรูด้านบนและทิ้งคราบกาวไว้
4) ขั้นแรก ให้ปิดสไลด์ เตรียมจานเพาะเชื้อขนาด 10 ซม. และนำกระดาษเช็ดปากที่แช่น้ำมาวางเพื่อทำเป็นกล่องเปียก
5) ใส่สไลด์ลงในจานเพาะเชื้อและปิดจานเพาะเชื้อ วางไว้ในภาชนะ CO₂ ฟักทิ้งไว้ประมาณ 30 นาที รอให้เจลแข็งตัว แล้วเตรียมเซลล์แขวนลอยไปพร้อมๆ กัน
6) เตรียมเซลล์ที่ย่อยแล้วให้เป็นเซลล์แขวนลอยที่มีความหนาแน่น 2*10⁵ เซลล์ต่อมิลลิลิตรแล้วผสมให้เข้ากัน
7) นำแผ่นแก้วที่บรรจุหลอดเลือดที่แข็งตัวเป็นเจลออก เติมเซลล์แขวนลอย 50 μl ลงในแต่ละหลุม โดยระวังอย่าให้ปลายปิเปตตั้งตรงเหนือหลุมบน และอย่าให้เจลในหลุมล่างสัมผัส
8) เติมอาหารเลี้ยงเซลล์ ปิดฝาแล้วปล่อยทิ้งไว้ หลังจากนั้นสักระยะ เซลล์ทั้งหมดจะจมลงสู่ผิวของ Matrigel

รูปที่ 4 กราฟผลการสร้างหลอดเลือดใหม่

การย้อมภูมิคุ้มกันเรืองแสง

1) นำตัวกลางออกจากหลุมอย่างระมัดระวังโดยไม่ให้โดนกาวหรือโครงข่ายเซลล์ เจือจางแคลเซอีนในตัวกลางที่ไม่มีซีรั่มจนมีความเข้มข้นสุดท้าย 6–8 µg/ml เติมสารละลายย้อมเซลล์ลงไปให้จมเซลล์จนหมด แล้วฟักที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30–40 นาทีในที่มืด
2) ล้างด้วย PBS สามครั้ง โปรดทราบว่าควรเติม PBS ลงในหลุมด้านบนอย่างช้าๆ เพื่อหลีกเลี่ยงการกระทบต่อเซลล์ การสังเกตการเรืองแสงโดยใช้ Ex=485 นาโนเมตร, Em=529 นาโนเมตร ความยาวคลื่น

รูปที่ 5 การย้อมอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ของหลอดเลือด

4.3 การเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ 3 มิติ

การเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ 3 มิติแตกต่างจากการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบดั้งเดิมตรงที่การเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ 3 มิติสามารถสร้างสภาพแวดล้อมของเซลล์ในร่างกายได้ แม้แต่แบบจำลองทรงกลมธรรมดาก็สามารถชดเชยข้อบกพร่องของการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบโมโนเลเยอร์ได้ โครงสร้างเหล่านี้สามารถสร้างระดับออกซิเจน สารอาหาร เมตาบอไลต์ และสัญญาณที่ละลายน้ำได้ ซึ่งจะสร้างประชากรเซลล์ที่หลากหลาย เทคโนโลยีการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ 3 มิติสามารถจำลองสภาพแวดล้อมตามธรรมชาติที่เซลล์อาศัยอยู่ในสิ่งมีชีวิตได้ดีขึ้น ทำให้ปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์และการตอบสนองทางชีวเคมีและสรีรวิทยามีความสมจริงมากขึ้น ในสภาพแวดล้อมแบบ 3 มิติ การตอบสนองของเซลล์ต่อสิ่งกระตุ้นภายในและภายนอกจะใกล้เคียงกับการตอบสนองในร่างกายมากขึ้น
การทำงานเฉพาะของเมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ ในการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ 3 มิติ มีดังนี้: ผสมเมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ กับสารแขวนลอยเซลล์เดี่ยว HepG2 ที่ปรับความเข้มข้นแล้วในอัตราส่วน 1:1 เบาๆ และเติมสารแขวนลอยเซลล์เดี่ยวที่ผสมข้างต้น 50 μl ลงในเพลต 24 หลุมที่ทำความเย็นไว้ล่วงหน้าโดยใช้ปลายปิเปตที่ทำความเย็นไว้ล่วงหน้าเพื่อสร้างหยดเซลล์รูปโค้ง เพาะเลี้ยงในตู้ฟักที่อุณหภูมิ 37°C, CO2 5% สังเกตและถ่ายภาพทุกวัน

รูปที่ 6 ผลการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ 3 มิติ

ตารางที่ 1 เมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์แบบ 3 มิติ อ้างอิงการใช้งาน:

หมายเหตุ: เมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ แต่ละชุดจะมีความเข้มข้นที่แตกต่างกัน ดังนั้นขนาดยาที่แนะนำนั้นเป็นเพียงข้อมูลอ้างอิงเท่านั้น

4.4 การทดลองการก่อตัวของเนื้องอกในร่างกาย

โดยใช้ตัวอย่างการทดลองการเกิดเนื้องอกใต้ผิวหนังของเซลล์ HepG2 ในหนูเปลือย เมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ และเซลล์ที่แขวนลอยถูกนำไปใช้ในการเจือจาง 1:1 และหนูตัวเมีย BALB/c-nu อายุ 4-5 สัปดาห์ได้รับการฉีดเข้าใต้ผิวหนัง กระบวนการทดลองมีดังนี้:
♦ เตรียมเซลล์ HepG2 ที่มีการเจริญเติบโตแบบลอการิทึมและความหนาแน่นของเซลล์ประมาณ 80-90% และเปลี่ยนอาหารสดในคืนก่อนที่จะเก็บเซลล์
♦ เซลล์จะถูกย่อยด้วยทริปซิน เมื่อเซลล์กลายเป็นทรงกลมและยังไม่หลุดออกจากจานเพาะเลี้ยง ทริปซินจะถูกนำออก เติมตัวกลางที่ไม่มีซีรั่มลงไปเพื่อทำให้เซลล์แขวนลอย จากนั้นปั่นเหวี่ยงและทำความสะอาดหนึ่งครั้ง และความเข้มข้นสุดท้ายคือ 5 × 10⁷ เซลล์/มล.
♦ เจือจางเซลล์แขวนลอยและเมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ ในอัตราส่วน 1:1 ที่อุณหภูมิ 4 ℃ เพื่อเตรียมความเข้มข้นสุดท้าย 5 × 10⁷ เซลล์/มล.
♦ จับหนูเปลือยตัวหนึ่งด้วยมือซ้าย แล้วฉีดเข้าใต้ผิวหนังบริเวณไหล่ขวาของหนูเปลือย ระหว่างการฉีดวัคซีน ให้แทงเข็มเข้าไปใต้ผิวหนังให้ลึกขึ้นอีกเล็กน้อย ประมาณ 1 ซม. เพื่อลดการไหลล้นของเซลล์ที่แขวนลอยออกมาจากรูเข็มหลังการฉีด
ปริมาตรการฉีดคือ 200 μ L (ขั้นตอนนี้ควรเสร็จสิ้นภายในครึ่งชั่วโมงเท่าที่จะเป็นไปได้ ระหว่างทางควรนำเซลล์ที่แขวนลอยไว้ไปวางบนน้ำแข็งเพื่อชะลอการตายของเซลล์และป้องกันไม่ให้เกิดปรากฏการณ์เจล)
♦ วางหนูเปลือยกลับเข้าไปในกรงเพื่อให้กินอาหารต่อไป และสามารถเห็นเนื้องอกได้ประมาณ 1 สัปดาห์ถึง 1 เดือนตามการออกแบบการทดลอง ทำการุณยฆาตหนูเปลือยเมื่อปริมาตรเนื้องอกตรงตามข้อกำหนด และถ่ายรูปไว้

หมายเหตุ: กลุ่มควบคุมคือการแขวนลอยของอาหารเลี้ยงเชื้อและเซลล์ และความหนาแน่นสุดท้ายจะเท่ากันกับกลุ่มทดสอบกาวเมทริกซ์

4.5 การเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์

ออร์แกนอยด์คือเนื้อเยื่อขนาดเล็กหลายเซลล์แบบ 3 มิติที่แยกความแตกต่างจากเซลล์ต้นกำเนิด คุณสมบัติบางประการของอวัยวะสามารถทำซ้ำได้ ออร์แกนอยด์เป็นเซลล์หลายเซลล์และแสดงการประกอบตัวเองในระดับสูง จึงสามารถแสดงการตอบสนองและปฏิสัมพันธ์ของเซลล์ในร่างกายที่ซับซ้อนได้ดีกว่าวัฒนธรรม 2 มิติแบบดั้งเดิม เซลล์ต้นกำเนิดและ/หรือเซลล์ต้นกำเนิดของอวัยวะจากเนื้อเยื่อปกติหรือเนื้อเยื่อที่เป็นโรคสามารถผสมกับเมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ หรือคอลลาเจนได้ เพื่อสร้างไต ต่อมไทรอยด์ ตับ สมอง ปอด ลำไส้ ต่อมลูกหมาก และอวัยวะขนาดเล็กอื่นๆ ตัวอย่างเช่น สำหรับนักวิจัยที่ดำเนินการคัดกรองทางพันธุกรรม สามารถใช้เมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ เป็นไบโออิงค์เพื่อให้สามารถระบุตำแหน่งและฝังเซลล์/ออร์แกนอยด์ที่มีชีวิตได้อย่างแม่นยำในการพิมพ์ชีวภาพแบบ 3 มิติ

รูปที่ 7 ขั้นตอนการผ่าตัดออร์แกนอยด์

โครงสร้างออร์แกนอยด์ลำไส้เล็กของหนู

การเตรียมตัวอย่าง: ฆ่าหนูโดยการตัดคอ และฉีดพ่นแอลกอฮอล์บนพื้นผิวเพื่อฆ่าเชื้อ ตัดเนื้อเยื่อลำไส้ออก 3~15 ซม. ใกล้ปลายกระเพาะอาหารภายใต้สภาพแวดล้อมที่ปลอดเชื้อ ใช้แหนบคีบเอาเยื่อเมเซนเทอรีและไขมันออกจากลำไส้อย่างระมัดระวัง แล้วใส่ลงในสารละลาย DPBS ที่มีแอนติบอดี 1% สองตัวที่ทำความเย็นล่วงหน้าที่ 4 ℃

การทำความสะอาดตัวอย่าง: ใช้เข็มฉีดยาล้างลำไส้ 2-3 ครั้ง ใช้กรรไกรผ่าตัดตัดลำไส้อย่างระมัดระวังโดยให้โพรงลำไส้หงายขึ้น และใช้ใบมีดผ่าตัดขูดวิลลัสของลำไส้เบา ๆ บนพื้นผิวของโพรงลำไส้ และหลังจากขูดวิลลัสของลำไส้ออกแล้ว (โดยให้เห็นเนื้อเยื่อโปร่งใส) ให้วางเนื้อเยื่อลำไส้ในจานเพาะเลี้ยงใหม่ที่มี DPBS 2-3 ครั้ง

การบำบัดเบื้องต้นของตัวอย่าง: ตัดเนื้อเยื่อลำไส้เล็กที่ล้างแล้วเป็นชิ้นเล็กๆ กว้าง 2 มม. จากนั้นใส่ลงในหลอดเหวี่ยงใหม่ขนาด 50 มล. ล้างเบาๆ 3-5 ครั้งด้วย DPBS เพื่อกำจัดเซลล์วิลลัสในลำไส้และเนื้อเยื่อไขมันลอย

การย่อยตัวอย่าง: เติม DPBS ที่ทำความเย็นไว้ล่วงหน้าจำนวน 10-15 มล. ซึ่งมี EDTA 3-5mM ลงในชิ้นส่วนลำไส้เล็กที่ทำความสะอาดแล้วเพื่อการย่อย ฟักที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลาประมาณ 30 นาที และเขย่าหลอดเหวี่ยงเบาๆ ทุกๆ 10 นาทีในช่วงเวลานี้

ภายหลังการย่อยแล้ว ให้ทิ้งของเหลวส่วนบนจากสารละลายย่อย EDTA ออกไป และล้างเนื้อเยื่อเบาๆ ด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ DPBS ใหม่ 2-3 ครั้ง เพื่อขจัด EDTA ที่เหลือออก

เติม DPBS ที่ทำความเย็นล่วงหน้า 10-15 มล. ที่มี BSA 0.1% ลงในชิ้นเนื้อลำไส้เล็ก เป่าและแขวนลอยชิ้นเนื้อซ้ำๆ เพื่อแยกช่องว่างออกจากชั้นฐาน จากนั้นนำสารแขวนลอยเล็กน้อยไปตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ เมื่อเห็นโครงสร้างคล้ายช่องว่างจำนวนมาก ให้หยุดเป่า และใช้ 70% สำหรับสารแขวนลอยเนื้อเยื่อที่เป่าแล้ว μM กรองตะแกรงเพื่อกรองและรวบรวมสารแขวนลอยเนื้อเยื่อที่ผ่านตะแกรงกรอง

ทำซ้ำขั้นตอน 5-6 สองครั้งแล้วปั่นที่ความเร็ว 1,500 รอบต่อนาที และอุณหภูมิ 4 ℃ เป็นเวลา 3 นาที

การก่อตัวของส่วนผสม: กาวเมทริกซ์ Ceturegel™ ที่มีความหนืดสูงจะตกตะกอนเนื้อเยื่อ ทุกๆ 10 μL ของกาวเมทริกซ์จะประกอบด้วยช่องว่าง 200~600 ช่องว่าง หลังจากแขวนลอยใหม่แล้ว ให้วางส่วนผสมบนน้ำแข็งและดำเนินการโดยเร็วที่สุดเพื่อหลีกเลี่ยงไม่ให้กาวเมทริกซ์ก่อตัวเป็นเจล
หมายเหตุ: อัตราส่วนการเจือจางของกาวเมทริกซ์ ≥ 50% เพื่อให้แน่ใจว่า Ceturegel™ ในกระบวนการเพาะเลี้ยงจะคงความเสถียรของโครงสร้างกาวเมทริกซ์

วางสารแขวนลอยแบบผสมไว้ตรงกลางด้านล่างของแผ่น 24 หลุม ประมาณ 30~50μL ต่อหลุมทางด้านซ้ายและขวา เพื่อหลีกเลี่ยงไม่ให้สารแขวนลอยสัมผัสกับผนังด้านข้างของแผ่นรูพรุน

วางจานเพาะเชื้อที่เพาะแล้วลงในตู้ฟักที่อุณหภูมิคงที่คาร์บอนไดออกไซด์ 37 องศาเซลเซียส และฟักเป็นเวลาประมาณ 30 นาที จนกระทั่งเจลเมทริกซ์แข็งตัว

รอ Ceturegel™ หลังจากที่กาวเมทริกซ์แข็งตัวสมบูรณ์แล้ว ให้ค่อยๆ เติมอาหารเลี้ยงอวัยวะลำไส้ที่เตรียมไว้ไปตามผนัง 800μL ต่อหลุม

ใส่เพลท 24 หลุมในตู้ฟักคาร์บอนไดออกไซด์ 37 องศาเซลเซียสเพื่อเพาะเลี้ยง เปลี่ยนอาหารเลี้ยงเชื้อใหม่ทุก 3 วัน และติดตามสถานะการเจริญเติบโตของอวัยวะที่คล้ายอวัยวะ โดยทั่วไป อวัยวะที่คล้ายอวัยวะในลำไส้เล็กของหนูจะก่อตัวภายใน 5-7 วัน

รูปที่ 8 ผลการเพาะเลี้ยงอวัยวะที่คล้ายลำไส้เล็กของหนูในหลอดทดลอง

5. คำถามที่พบบ่อย

1. เหตุใดสีของพื้นผิวที่ได้จึงต่างกัน (เหลืองอ่อนถึงแดงเข้ม)?
สำหรับเมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ ที่มีฟีนอลเรด เกิดจากปฏิกิริยาระหว่างฟีนอลเรดและไบคาร์บอเนตกับ CO เป็นหลัก₂แต่ความแตกต่างของสีจะลดลงหลังจากปรับสมดุลด้วย CO 5%₂หลังจากการแช่แข็งและละลายแล้ว เขย่าขวดเบาๆ เพื่อกระจายเมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ ให้ทั่วถึงกัน
2. สิ่งสำคัญใดบ้างที่ควรใส่ใจในการใช้งานเมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™
การดำเนินการทั้งหมดควรดำเนินการในสภาพแวดล้อมที่ปลอดเชื้อ และควรใช้ปิเปตที่ทำความเย็นไว้ล่วงหน้าเพื่อให้แน่ใจว่าเมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ ได้รับการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน
3. วิธีการแช่แข็งและจัดเก็บเมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ เพื่อใช้งาน
เมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ LDEV-Free Ceturegel™ ที่แช่แข็งและละลายแล้วสามารถกระจายได้ในหลอดทดลองขนาดเล็กหลายหลอด การจัดจำหน่ายทั้งหมดควรอยู่ในหลอดแช่แข็งที่ทำความเย็นไว้ล่วงหน้า ซึ่งควรแช่แข็งอย่างรวดเร็วและจัดเก็บเพื่อหลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายหลายครั้ง ควรทำให้อุปกรณ์ที่เกี่ยวข้องทั้งหมดเย็นลงล่วงหน้าก่อนใช้งาน ใช้ปิเปต ทิป และหลอดทดลองขนาดเล็กที่ทำความเย็นไว้ล่วงหน้าในการจัดการเมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™

6. คำแนะนำในการเลือกเมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ จาก Yeasen

เมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ ชนิดต่างๆ มีการใช้งานที่แตกต่างกัน เมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ ที่มีความเข้มข้นมาตรฐานสามารถใช้สำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ขั้ว เช่น เซลล์เยื่อบุผิว เมทริกซ์นี้สามารถส่งเสริมการแบ่งตัวของเซลล์ต่างๆ และใช้สำหรับการทดลองการอพยพและการบุกรุกของเซลล์เนื้องอก เมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ ที่มีความเข้มข้นสูงใช้กันอย่างแพร่หลายในร่างกายและสามารถใช้สำหรับการทดลองการสร้างท่อไต หน้าที่หลักของปัจจัยการเจริญเติบโตต่ำ (GFR) คือการกำจัดการรบกวนของปัจจัยการเจริญเติบโตในการทดลอง และเหมาะสำหรับการศึกษาที่มีความต้องการสูงในการเตรียมเยื่อฐาน เมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ ที่ไม่มีฟีนอลเรดสามารถกำจัดการรบกวนของตัวบ่งชี้ฟีนอลเรด และเหมาะสำหรับการทดลองการพัฒนาสี เช่น การวัดสีและการตรวจจับการเรืองแสง เมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ เกรดการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนมนุษย์ ใช้โดยเฉพาะสำหรับการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนมนุษย์ การเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนแบบไม่มีฟีดเดอร์ที่เหนี่ยวนำ Yeasen มีเมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ หลายประเภท คุณสามารถเลือกได้ตามการทดลองของคุณ

ตารางที่ 2. คู่มือการเลือกเมทริกซ์ Ceturegel™

ประเภทสินค้า	หมายเลขแมว	ชื่อสินค้า	แมว Matrigel หมายเลข	ทิศทางการใช้งาน
ความเข้มข้นเบส (8-12 มก./มล.)	40183ES	Ceturegel™ Matrix ปราศจาก LDEV	356234/ 354234	ปรับให้เข้ากับการทดลองเพาะเลี้ยง การบุกรุก และการอพยพแบบ 2 มิติและ 3 มิติ และยังสามารถใช้สำหรับการทดลองการก่อมะเร็งในร่างกายได้อีกด้วย
	40184ES	Ceturegel™ ปราศจากฟีนอลเรด ปราศจาก LDEV	356237	ส่วนใหญ่ใช้สำหรับการตรวจจับสี เช่น การทดลองตรวจจับการเรืองแสง เป็นต้น
การลดปัจจัยการเจริญเติบโต	40185ES	Ceturegel™ Matrix GFR ปราศจาก LDEV	354230	หลักๆ คือ เพื่อตัดปัจจัยการเจริญเติบโตที่รบกวนการทดลองออกไป นำไปประยุกต์ใช้ในงานวิจัยที่เกี่ยวข้องกับปัจจัยการเจริญเติบโต เส้นทางการส่งสัญญาณ ฯลฯ
	40186ES	Ceturegel™Matrix GFR, ปราศจากฟีนอลเรด, ปราศจาก LDEV	356231
ความเข้มข้นสูง (≥18มก./มล.)	40187ES	Ceturegel™ Matrix ความเข้มข้นสูง ปราศจาก LDEV	354248	ส่วนใหญ่ใช้ในการทดลอง เช่น การสร้างหลอดเลือดใหม่ การอุดหลอดเลือดด้วยเจล และการก่อตัวของเนื้องอกในร่างกาย (สำหรับการสร้างหลอดเลือดใหม่ ขอแนะนำว่าความเข้มข้นสุดท้ายของเมทริกซ์เยื่อฐาน Ceturegel™ ควรอยู่ที่ ≥10 มก./มล.)
	40189ES -การสอบถาม-	Ceturegel™ Matrix ความเข้มข้นสูง, GFR, ปราศจาก LDEV	354263
	40188ES	Ceturegel™ Matrix ความเข้มข้นสูง ปราศจากฟีนอลเรด ปราศจาก LDEV	354262
สำหรับเซลล์ต้นกำเนิด	40190ES	Ceturegel™ Matrix มีคุณสมบัติ hESC ปราศจาก LDEV	354277	ส่วนใหญ่ใช้ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ต้นกำเนิด เช่น hESC, iPSC เป็นต้น
เฉพาะออร์แกนอยด์	40191ES -การสอบถาม-	เมทริกซ์ Ceturegel™ สำหรับการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์ ปราศจากฟีนอลเรด ปราศจาก LDEV	356255	เมทริกซ์เมมเบรนฐาน Ceturegel™ สำหรับการเพาะเลี้ยงออร์แกนอยด์