1. Dendritik hücreler (DC) nedir?
Dendritik hücreler (DC'ler), insan vücudundaki en etkili antijen sunan hücrelerdir (APC'ler). DC'ler, saf T hücresi çoğalmasını güçlü bir şekilde uyarabilen tek APC'lerdir. Diğer APC tipleri (monositler, makrofajlar, B hücreleri vb.) yalnızca aktive edilmiş veya hafıza T hücrelerini uyarabilir. Bu nedenle, DC hücreleri adaptif T hücresi bağışıklık tepkilerinin başlatıcılarıdır ve tümör bağışıklığında son derece önemli bir rol oynarlar. DC hücreleri, yüzeylerinde MHC-I ve MHC-II moleküllerini yüksek oranda ifade eder ve spesifik yüzey belirteçlerine sahiptir. Antijenleri aktive etmek için T hücrelerini alır, işler ve uyarır ve nihayetinde T hücrelerinin farklılaşma yönünü belirlerler.
2. DC Kaynağı
DC hücreleri vücutta çok az miktarda bulunur. DC'yi doğrudan vücuttan izole etmek uzun zaman alır ve hücre verimi çok düşüktür, bu da DC'nin araştırılmasını ve uygulanmasını büyük ölçüde sınırlar. Ancak DC, kemik iliği sıvısındaki öncü hücreler, periferik kandaki monositler ve göbek kordonu kanı gibi farklı dokulardaki DC öncü hücrelerinden farklılaştırılabilir ve indüklenebilir.
İnsanlar için, insan periferik kanı elde edilmesi en kolay olan ve en fazla monosit sayısına sahip olduğundan, en yaygın kullanılan yöntem DC'yi insan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) indüklemektir. Fareler için, en yaygın yöntem DC'yi kemik iliği hücrelerinden, yani kemik iliğinden türetilen dendritik hücrelerden (BMDC) indüklemektir.
Şekil 1. Klasik BMDC hazırlama yönteminin şematik diyagramı
3. BMDC Hazırlık Yöntemi
Fare BMDC'lerini hazırlamak için yaygın yöntemler şunlardır:
3.1 Klasik BMDC kültür yöntemi - Inaba yöntemi (modifiye)
3.2 BMDC'nin büyük ölçekli hazırlanması - Sons yöntemi
3.3 BMDC - Lutz yönteminin büyük ölçekli hazırlanması
3.1 [Klasik BMDC kültür yöntemi] - Inaba yöntemi (geliştirilmiş)
【Arka plan】
A. Inaba yöntemi ile elde edilen BMDC sayısı 5-7 x 106/fare;
B. Orijinal Inaba yöntemi BMDC'lerin üretimini başlatmak için yalnızca GM-CSF kullanır. Elde edilen BMDC'ler karışık lenfosit reaksiyonunda güçlü bir uyarıcı yeteneğe sahip olsa da, DC'lerin olgunluğu GM-CSF+IL-4'ün birleşik indüksiyonu kadar iyi değildir. Bu nedenle, daha sonra geliştirilen yöntem genellikle GM-CSF+IL-4'ün birleşik indüksiyonunu kullanır.
【Yetiştirme adımları】
3.1.1 Fare Kemik İliği Hücrelerinin Elde Edilmesi
1) Fareler (6-10 haftalık) boyun çıkığı yapılarak öldürüldü, tüm femur ve tibialar cerrahi olarak çıkarıldı ve kemiklerin etrafındaki kas dokusu makas ve forseps yardımıyla mümkün olduğunca çıkarıldı.
[Not] Kemiklere zarar vermeyin.
2) Kemiği temiz tezgaha alın ve dezenfekte ve sterilize etmek için %70 alkol içeren steril bir kültür kabında 2-5 dakika bekletin, ardından steril PBS ile iki kez yıkayın.
3) Kemiği PBS içeren başka bir yeni kültür kabına taşıyın, kemiğin iki ucunu makasla kesin ve ardından PBS'yi çıkarmak için bir şırınga kullanın. İğneyi kemiğin her iki ucundan kemik iliği boşluğuna yerleştirin ve kemik tamamen beyazlaşana kadar kemik iliğini kültür kabına tekrar tekrar yıkayın.
4) Kemik iliği süspansiyonunu toplayın ve 200 meshlik naylon bir süzgeçle küçük parçaları ve kas dokusunu süzün.
5) Filtratı 1200 derecede santrifüjleyin rpm için 5 dk ve üstteki sıvıyı atın.
6) 2 ml amonyum klorür kırmızı kan hücresi lizis tamponu (1x) ekleyin, hücreleri yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 3-5 dk, 10'a kadar en az.
7) Lizis tamponunun etkisini nötralize etmek için 10 ml PBS ekleyin, ardından 1200 rpm'de santrifüjleyin. 5 dk ve üstteki sıvıyı atın.
8) Bir kez PBS ile yıkayın ve ardından hücreleri %10 FBS içeren RPMI1640 kültür ortamında yeniden süspanse edin. Fare kemik iliği hücreleri elde edildi.
Amonyum klorür kırmızı kan hücresi lizis çözeltisinin hazırlanması:
A. Aşağıdaki gibi 10x depolama solüsyonu hazırlayın: 82,9 tartın g NH4Cl, 10.0g KHCO3 ve 0,37 g Na2EDTA, 1L damıtılmış suda çözülür, 0,22 ile süzülür μm filtre membranını sterilize edin ve 4℃'de 6 ay saklayın;
B. Kullanmadan önce 10x saklama solüsyonunu steril damıtılmış suyla 1:9 ila 1x çalışma solüsyonu oranında seyreltin.
[Not] Amonyum klorür eritrosit lizis solüsyonunun kemik iliği hücreleri üzerinde belli bir zararlı etkisi olduğundan hemoliz süresi mümkün olduğunca kısaltılmalıdır.
3.1.2 BMDC farklılaşmasının indüksiyonu
1) 1. adımda elde edilen fare kemik iliği hücrelerini sayın ve hücre konsantrasyonunu 0,5-1× 10'a ayarlayın6/ml, %10 FBS içeren RPMI 1640 tam kültür ortamı ile.
2) 24 kuyulu bir kültür plakasına, kuyu başına 1 ml hücre ekleyin, rekombinant fare GM-CSF (20) ekleyin ng/ml) ve IL-4 (10 ng/ml), ve 37℃, %5 CO2'de kültür2 inkübatör. Bu kültürün 0. günü.
【Not】
A. Genellikle yaklaşık 4-5x107 Kemik iliği hücreleri bir fareden elde edilebildiğinden, 24-kuyulu bir plakanın en az 40-50 kuyusu kaplanabilmektedir.
B. GM-CSF ve IL-4'ün konsantrasyon aralıkları 20-50'dir ng/ml ve 10-40 ng/mlSırasıyla.
3) Kültür plağını 2 günde bir hafifçe çalkalayın, ardından hacmin 3/4'ünü taze kültür ortamıyla değiştirin ve sitokinleri yenileyin.
4) 5. ve 8. günler arasında kültür ortamına hafifçe üfleyerek askıdaki hücreleri ve gevşekçe tutunmuş hücreleri toplayın.
5) 1200'de santrifüj rpm için 5 dk ve üstteki sıvıyı atın.
6) Hücreleri %10 FBS içeren RPMI 1640 tam kültür ortamında yeniden süspanse edin ve sayın, ardından hücre konsantrasyonunu 1×10'a ayarlayın6/ml ve rekombinant fare GM-CSF'yi (20) ekleyin ng/ml) ve IL-4 (10 ng/ml).
7 ) Hücreleri 100 mm'lik kültür kaplarına (kap başına 10 ml'ye kadar) veya 6-kuyucuklu kültür kaplarına (kuyucuk başına 2 m) yerleştirin.
8) 37℃, %5 CO2'de kültüre devam edin2 1-2 gün kuluçka makinesinde bekletilir.
9) Daha olgun BMDC'ler olan askıdaki hücreleri toplayın.
【Not】
A. 2.5-2.8 adımları tekrar kaplama adımlarıdır ve amacı 2.4 adımında elde edilen BMDC'yi daha olgun hale getirmektir.
B. Tekrar plakalandıktan 3 saat sonra, çok sayıda dikenli yapışık hücrenin DC kümelerinden göç ettiği görülebilir ve 1 günlük kültürden sonra, bu yapışık hücrelerin kültür plakasının tabanından ayrıldığı ve birçok tipik DC'nin kültür ortamında yüzdüğü görülebilir.
3.1.3 BMDC'nin tam olgunlaşması
[Not] 2. adımda elde edilen BMDC'ler tam olgun DC'ler değildir. Tam olgun DC'ler elde etmek istiyorsanız, yine de LPS, CD40L veya TNF-a ile indüklenmeniz gerekir.
1) 2.4 veya 2.9 adımında elde edilen BMDC'yi 1200°C'de santrifüjleyin. rpm için 5 dk ve üstteki sıvıyı atın.
2) Çökeltiyi rekombinant fare GM-CSF (20) içeren RPMI tam kültür ortamıyla yeniden süspanse edin ng/ml) ve IL-4 (10 ng/ml), ve hücre konsantrasyonunu 1×10'a ayarlayın6/ml sayıldıktan sonra.
3) 24 kuyulu kültür plakalarına ekleyin ve TNF-α (250) gibi olgunlaşma indükleyicileri ekleyin U/mL), LPS (1 μg/mL) veya CD40L (1 (μg/mL).
4) 37℃, %5 CO2'de kültür2 2 gün kuluçka makinesinde bekletilir.
5) Askıdaki hücreleri ve duvara gevşek bir şekilde tutunarak büyüyen hücreleri, yani olgun dendritik hücreleri toplayın.
3.2【BMDC seri üretim yöntemi】-Son yöntemi
【Arka plan】
A. Bu yöntemle 30-40×10 elde edilebilir6 7 gün içinde DC/fare, Inaba klasik yönteminin 7-10 katıdır. DC %14,5 metrizamid gradyanı ile santrifüj edildikten sonra, saflık (yani CD11c+/I-Ab+ hücreler) %85-95'e ulaşabilir.
B. Bu yöntemle elde edilen DC'nin endositoz yeteneği Inaba klasik yöntemine göre daha zayıftır, ancak salgılanan IL-12p70 miktarı benzerdir.
C. Bu yöntemle elde edilen DC, Inaba klasik yöntemine göre karma lenfosit reaksiyonunda daha güçlü uyarılma yeteneğine sahiptir.
D. Bu yöntemle elde edilen DC, daha güçlü spesifik T hücre yanıtına neden olabilir.
ve. Özetle, Son yöntemi klasik yönteme göre daha fazla ve daha olgun BMDC elde edebilmektedir.
【Yetiştirme adımları】
3.2.1 Fare kemik iliği hücrelerinin elde edilmesi
Inaba yöntemindeki (değiştirilmiş) ilgili adımlara bakın.
3.2.2 Büyük miktarlarda BMDC hazırlanması
1) 1. adımda elde edilen fare kemik iliği hücrelerini sayın ve hücre konsantrasyonunu 2×10'a ayarlayın5/ml RPMI 1640 tam kültür ortamı ile %10 FBS içerir.
2) 6 kuyulu kültür plakalarına, kuyu başına 5 ml hücre olacak şekilde yayın, rekombinant fare GM-CSF (1000 U/mL) ve IL-4 (1000 U/mL), ve 37℃, %5 CO2'de kültür2 kuluçka makinesi.
3) Kültürün 4. gününde, kültür sistemini rekombinant fare GM-CSF (1000) ile destekleyin. U/mL) ve IL-4 (1000 U/mL).
4) Kültürün 7. gününde DC'leri toplayın, 2-4 ml ile yeniden süspanse edin. ml RPMI 1640 tam kültür ortamına eşit hacimde %14,5 (a/h) mepanema ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika santrifüj edin 1200xg'de en az.
5) Orta tabakayı toplayın ve daha sonra kullanmak üzere RPMI 1640 tam kültür ortamıyla üç kez yıkayın.
[Not] Bu noktada DC olgunlaşmamış bir BMDC'dir. Daha da olgunlaştırmak istiyorsanız lütfen 3. adıma geçin.
3.2.3 BMDC'nin tam olgunluğu
1) Adım 2.4'te toplanan BMDC'leri tekrar plaka haline getirin ve rekombinant fare GM-CSF (1000) ekleyin U/mL) ve IL-4 (1000 U/mL), LPS (1-10) gibi μg/mL) kültür sistemine
2) 37℃, %5 CO2'de kültürlendi2 Olgun BMDC'leri elde etmek için 2 gün boyunca inkübatörde bekletilir.
3.3【BMDC kütle hazırlama yöntemi】-Lutz yöntemi
【Arka plan】
A. Lutz yöntemi, Son yöntemine benzemektedir ve her iki yöntemle de büyük miktarlarda BMDC hazırlanabilmektedir, ancak Lutz yöntemi, Son yöntemine göre daha yaygın olarak kullanılmaktadır.
B. Bu yöntemle 1-3 x 10'a kadar daha fazla BMDC elde edilebilir8 DC/fare ve saflık %90-95'e ulaşabilir;
C. Bu yöntemde kullanılan sitokin konsantrasyonu Son yöntemindekinden çok daha düşüktür, sadece 200 U/mLve 30-100'e düşer U/mL kültürün 8. gününden 10. gününe kadar, bu da reaktif maliyetinden büyük ölçüde tasarruf sağlayabilir;
D. Bu yöntem ile Inaba klasik yöntemi ve Son yöntemi arasındaki en büyük fark, kemik iliği hücrelerinin hücre kültürü plakası yerine bakteri kültürü kabında (Petri kabı) kültürlenmesidir. Inaba, bakteri kültürü kabının kemik iliğindeki makrofajların duvara yapışmasını kolaylaştırmadığını, böylece makrofajların gelişimini engellediğini ve makrofajların DC olgunlaşması üzerindeki engelleyici etkisinden kaçınıldığını açıkladı. Bu, bu yöntemin daha düşük plaka yoğunluğunda çok sayıda BMDC elde edebilmesinin ana nedeni olabilir.
ve. Ancak bu yöntemin kültür süresi nispeten uzundur ve 10-12 gün gerektirir. Bir yandan, bu daha fazla BMDC elde etmek içindir. Öte yandan, çoğu granülosit ve lenfositin bu kadar uzun süre hayatta kalması zordur, bu nedenle sonunda elde edilen BMDC'lerin saflığı iyileştirilebilir;
F. Bu yöntem indüksiyon kültürü için yalnızca GM-CSF kullanır ve elde edilen BMDC'ler hem olgunlaşmamış hem de olgun DC'leri içerir. Olgunluğu daha da iyileştirmek için, LPS veya TNF-α'nın indüksiyonun 1-2 günü daha kullanılması gerekir ve olgun DC hücrelerinin içeriği %50-70'e ulaşacaktır.
【Yetiştirme adımları】
3.3.1 Fare kemik iliği hücrelerinin elde edilmesi
Inaba yöntemindeki (değiştirilmiş) ilgili adımlara bakın ve hemoliz adımının atlanması gerektiğini unutmayın.
3.3.2 BMDC'nin büyük ölçekli hazırlığı
1) 1. adımda elde edilen fare kemik iliği hücrelerini sayın ve hücre konsantrasyonunu 2×10'a ayarlayın5/ml, %10 FBS içeren RPMI 1640 tam kültür ortamı ile;
2) 100 mm'lik bakteri kültür kaplarına (Petri Kabı) yayın, kap başına 10 ml hücre ekleyin ve rekombinant fare GM-CSF (200 U/mL), ve 37℃, %5 CO2 inkübatöründe kültür;
[Not] Burada hücre kültürü plakaları değil, bakteri kültürü plakaları kullanılmaktadır.
3) 3. gün, 20 içeren 10 ml tam kültür ortamı ekleyin. ng/ml rekombinant fare GM-CSF'yi kültür kabına;
4) 6. ve 8. günlerde ortamın yarısını değiştirin, yani eski kültür ortamını toplayın, hücre peletini 20 içeren tam kültür ortamıyla yeniden süspanse edin. ng/ml santrifüjlemeden sonra rekombinant fare GM-CSF'si ve ardından hücre süspansiyonunu orijinal kaba geri koyun;
5) 10. günde hücreler toplanabilir, bunlar BMDC'lerdir.
3.3.3 BMDC'lerin tam olgunlaşması
1) Kültürün 10. gününde DC'leri bir pipetle hafifçe üfleyerek süspanse edilmiş hücreleri toplayın ve oda sıcaklığında 300xg'de 5 dakika santrifüj edin;
2) Üstteki sıvıyı atın, hücre pelletini 10 ml RPMI 1640 tam kültür ortamıyla tekrar süspanse edin ve ardından 100 mm'lik hücre kültürü plakasına yayın;
3) Rekombinant fare GM-CSF'yi (100) ekleyin U/mL) ve TNF-α (500 U/mL), veya rekombinant fare GM-CSF (100 U/mL) ve LPS (1) μg/mL);
4) 37℃, %5 CO2'de kültüre devam edin2 1-2 gün kuluçka makinesinde bekletilir.
4. BMDC'lerin tanımlanması
ben Morfolojik gözlem: BMDC'lerin çoğu koloniler halinde büyür ve hücrelerde olgun BMDC'lerde daha belirgin olan çok sayıda dendritik çıkıntı bulunur.
ben Hücre fenotipi analizi: DC hücrelerinin yüzeyinde CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC sınıf II moleküllerinin (IA/IE) ekspresyonunu tespit etmek için akış sitometrisi kullanıldı. BMDC'ler bu molekülleri yüksek oranda eksprese eder ve bu moleküllerin tamamen olgun BMDC'lerdeki ekspresyonu daha da artacaktır.
ben Karma lenfosit reaksiyonu (MLR): BMDC’lerin güçlü uyarıcı yetenekleri vardır ve olgunluk ne kadar yüksekse uyarıcı yetenekleri de o kadar güçlüdür.
5. Olgunlaşma indükleyicisi nasıl seçilir?
LPS, CD40L ve TNF-α hem insan DC hem de fare DC için yaygın olarak kullanılan ve etkili olgunlaşma indükleyicileridir. TNF-a, üçü arasında DC olgunlaşmasını indüklemede en zayıf yeteneğe sahiptir. LPS ve CD40L, her ikisi de in vitro DC tam olgunlaşması için güçlü indükleyicilerdir. Her ikisi tarafından indüklenen DC olgunlaşması benzerdir, ancak indüklenen sitokin spektrumu farklıdır. CD40L ile indüklenen olgun BMDC, koruyucu ve terapötik tümör bağışıklık tepkilerinin oluşturulması da dahil olmak üzere, in vivo en güçlü immün düzenleyici yeteneği gösterir. LPS ile DC tam olgunlaşmasını uyarmak için kullanılan konsantrasyon genellikle 1-10'dur μg/mL, ama aslında 0,1 μg/mL'nin çok güçlü bir etkisi var, ancak sigorta amaçlı olarak, 1 Genellikle μg/mL kullanılır. CD40L moleküllerinin, yalnızca trimerler oluşturduktan sonra işlev görebilmeleriyle karakterize edilen TNF ligand ailesine ait olduğu unutulmamalıdır. Bu nedenle, DC'yi uyarmak için rekombinant CD40L trimer proteini kullanmak en iyisidir, bu da iyi bir etki yaratacaktır. CD40L monomerleri DC'yi uyarmak için kullanılırsa, olgunluk çoğu durumda çok yüksek değildir.
6. Eğitim yönteminin seçimi
Tablo 1.BMDC hazırlamak için üç yaygın deneysel yöntemin karşılaştırılması
| Parametre | Klasik BMDC kültür yöntemi - Inaba yöntemi | BMDC - Son yönteminin büyük ölçekli hazırlanması | BMDC - Lutz yönteminin büyük ölçekli hazırlanması |
| PubMed'deki atıf sayısı | 783 | 24 | 663 |
| Kemik iliği hemolizi, kırmızı kan hücrelerinin lizi | EVET | EVET | HAYIR |
| Kemik iliği ilk önce lenfositleri temizler | EVET | HAYIR | HAYIR |
| Kültür sırasında granülositlerin uzaklaştırılması | EVET | HAYIR | HAYIR |
| Kemik iliği hücrelerinin başlangıç kaplama hacmi | 1ml | 15ml | 10ml |
| Kuluçka makinesi | 24 kuyulu hücre kültürü plakaları | 6-kuyulu hücre kültürü plakası | 100mm bakteri kültürü kabı |
| Kültür ortamı | RPMI 1640+10% FCS | ||
| Fare GM-CSF konsantrasyonu | 200-1000 U/mL | İlk eklenen konsantrasyon 125-1000'dir U/mL 4. ve 7. günlerde kültür sistemine yeterli miktarda GM-CSF ve IL-4 eklenir. | Başlangıçta eklenen konsantrasyon 200'dür U/mL.3-100 U/mL 10. günden sonra |
| Fare IL-4 | Gerek yok | İhtiyaç，Konsantrasyon GM-CSF ile aynıdır | Gerek yok |
| Sıvı değişim yöntemi | 2. ve 4. günlerde eski kültür ortamının (içinde hücre bulunan) %50-75'ini atıp yerine yeterli GM-CSF içeren taze tam kültür ortamı koyun. | / | 3. günde, GM-CSF içeren tam kültür ortamının eşit hacmi eklendi. 6., 8. ve 10. günlerde, ortamın yarısı değiştirildi. Eski kültür ortamı (hücreler içeren) aspire edildi, santrifüj edildi, GM-CSF içeren taze tam kültür ortamında yeniden süspanse edildi ve sonra geri konuldu. |
| Geçiş öncesi kültür zamanı (genişleme) | 6 gün | 7 gün | 10 gün |
| Geçişten (olgunlaşmadan) sonraki kültür süresi | 2 gün | Hiçbiri | 1-2 gün |
| Tam olgunluk indükleyicisi | TNF-ɑ（250 U/mL） | LPS(1-10 (μg/mL) | TNF-ɑ（250 U/mL）veya LPS(1) (μg/mL) |
| DC hücre hasadı zamanı | 7-8 gün | 7-8 gün | 10-13 gün |
| DC Saflığı | 8. Gün：%60-70 | 7. Gün：%85-95 | 10-12. Gün：%80-90 |
| DC üretimi/fare | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. Önerilen DC kültür reaktifleri
| Ürün Adı | Kedi | Boyut |
| 91108Türkçe | 5 μg/50 μg/100 μg/500 mikrogram | |
| 90144ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 mikrogram | |
| 90621ES | 5 μg/20 μg/50 μg/500 mikrogram | |
| 94016ES | 25 μg/100 μg/500 mikrogram |