1.Önsöz
Makrofajlar, kanda monositlerden farklılaşmış büyük fagositlerdir. Neredeyse tüm dokularda, özellikle de cilt, akciğerler ve bağırsaklar gibi dış dünyayla sık temas halinde olanlarda bulunurlar. Makrofajlar, insan bağışıklık savunması, inflamatuar yanıt, doku onarımı, bağışıklık düzenlemesi ve hastalık gelişimi gibi birçok biyolojik süreçte hayati bir rol oynar.
Birincil insan makrofajlarının dokulardan yeterli sayıda izole edilmesi zordur ve kültürde çoğalmazlar. Monosit kaynaklı makrofajlar mükemmel bir alternatif sunar çünkü insan kanındaki monositler büyük miktarlarda kolayca elde edilebilir ve in vitro makrofajlara farklılaştırılabilir.
2.Makrofajların biyolojik fonksiyonları
- Fagositoz
Makrofajlar, yüzeylerindeki reseptörler aracılığıyla patojenleri ve ölü hücre artıklarını tanır ve yutar. Bu süreç yalnızca enfeksiyonu temizlemeye yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda bu maddelerin vücutta birikmesini ve iltihaplanmaya veya başka sorunlara neden olmasını da önler.
- Patojenlere karşı savunma
Makrofajlar, reaktif oksijen ve azot oksitler gibi mikroorganizmaları öldüren kimyasalların yanı sıra inflamasyon yanıtlarını düzenleyen sitokinler ve kemokinler üreterek patojenlerle savaşır.
- İnflamasyon düzenlemesi
Makrofajlar inflamatuar yanıtlarda karmaşık bir rol oynar. Sadece tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) ve interlökin 1 (IL-1) gibi proinflamatuar sitokinleri serbest bırakarak inflamasyonu teşvik etmekle kalmaz, aynı zamanda IL-10 ve TGF-β gibi antiinflamatuar sitokinleri üreterek inflamasyonu da inhibe edebilirler.
- Doku onarımı ve rekonstrüksiyonu
Bir inflamatuar yanıttan sonra, makrofajlar çeşitli büyüme faktörleri salgılayarak dokuların onarılmasına ve yenilenmesine yardımcı olur. Hasar kalıntılarını temizlerken yeni dokuların oluşumunu teşvik ederler.
- İmmünomodülasyon
Makrofajlar, antijenleri T hücrelerine sunarak spesifik bağışıklık tepkilerini teşvik eder. Aynı zamanda, T hücrelerinin ve B hücrelerinin aktivitesini düzenlemek gibi çeşitli sitokinleri salgılayarak bağışıklık sisteminin diğer bileşenlerini düzenlerler.
- Hastalıklarla ilişkisi
Makrofajlar, enfeksiyon hastalıkları, otoimmün hastalıklar, tümörler ve ateroskleroz gibi kronik inflamatuar hastalıklar da dahil olmak üzere birçok hastalığın gelişiminde önemli rol oynarlar.
3. Makrofajların sınıflandırılması
Aktivasyon durumlarına ve işlevlerine göre makrofajlar iki ana kategoriye ayrılabilir: M1 ve M2. Bu iki alt tip, bağışıklık tepkisi ve inflamasyon düzenlemesinde farklı roller oynar.
M1 makrofajları
M1 makrofajları esas olarak interferon gama (IFN-γ) ve tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) gibi sitokinler tarafından uyarılır ve proinflamatuar özelliklere sahiptir. Güçlü antimikrobiyal aktiviteye sahiptirler, oksijen serbest radikalleri ve inflamatuar faktörler üretebilirler ve bakteri ve virüsler gibi patojenik mikroorganizmaları öldürmeye ve temizlemeye katılırlar.
M1 makrofajları vücudun bağışıklık savunmasında ve inflamatuvar yanıtta rol oynar, inflamatuvar ve bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonunu teşvik eder, enfekte ve hasarlı dokuların temizlenmesine yardımcı olur ve immün inflamatuvar yanıtların oluşumunu ve sürdürülmesini teşvik eder.
M2 makrofajları
M2 makrofajları esas olarak interlökin-4 (IL-4) ve interlökin-13 (IL-13) gibi sitokinler tarafından uyarılır ve anti-inflamatuar ve onarım özelliklerine sahiptir. Doku onarım ve rejenerasyon süreçlerine katılırlar, anti-inflamatuar yanıtları ve bağışıklık düzenlemesini desteklerler.
M2 makrofajlar inflamasyonun geç evresinde ve doku onarımında önemli rol oynar, inflamasyonun çözülmesini ve doku onarımını destekler, bağışıklık tepkilerinin dengesini düzenler, doku rejenerasyonu ve onarımını destekler.
Şekil 1. Aktif makrofajların ana makrofaj polarizasyon durumlarının özeti [1]
4. Makrofajların in vitro izolasyonu, kültürü ve farklılaştırılması
4.1 Ayırma yöntemi
- Periferik kandan izolasyon
Monositlerin izolasyonu: Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) yoğunluk gradyan santrifüjü (örneğin, Ficoll-Paque) kullanılarak izole edilir. Kan örneği Ficoll'un üst katmanına eklenir ve santrifüjden sonra monositler plazma ve Ficoll katmanları arasında yer alır.
Makrofajların izolasyonu: Monositler PBMC'lerden izole edildikten sonra, mononükleer öncü hücreler plastik yapışma yoluyla daha fazla izole edilebilir. Monositler plastik kültür kaplarında birkaç saat kültüre edilir, yapışmayan hücreler çıkarılır ve kalan yapışan hücreler çoğunlukla mononükleer öncü hücrelerdir.
- Dokulardan izolasyon
Doku örnekleri mekanik ve/veya enzimatik işlemle (örneğin, kolajenaz ve DNase) tek hücre süspansiyonlarına ayrılır. Hedef olmayan hücreler yoğunluk gradyan santrifüjü veya negatif seçimle (antikorlar ve manyetik boncuklar kullanılarak) uzaklaştırılır ve makrofajlar toplanır.
4.2 Kültür yöntemi
Yaygın olarak kullanılan kültür ortamları arasında genellikle %10 fetal bovin serumu (FBS), %1 penisilin/streptomisin ve gerekli büyüme faktörleriyle desteklenmesi gereken RPMI 1640 veya IMDM bulunur. Kültür koşulları genellikle 37°C'de ve %5 CO2'de bir inkübatördedir
4.3 Farklılaşma tümevarım yöntemi
- Mononükleer öncü hücrelerden farklılaşma
M-CSF'yi kullanma: Kültür ortamına genellikle 20-50 ng/mL konsantrasyonda makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) eklenir ve mononükleer öncü hücrelerin makrofajlara farklılaşmasını sağlamak için 7-10 gün boyunca kültüre devam edilir.
GM-CSF'yi kullanma: Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) de makrofajların farklılaşmasını, özellikle M1 (pro-inflamatuar) makrofaj üretme eğilimini indükleyebilir.
- Fenotip ve fonksiyonun daha fazla düzenlenmesi
M1 makrofajlar: Kültür ortamına IFN-γ (interferon-γ) ve LPS (lipopolisakkarit) eklenerek indüklenebilir.
M2 makrofajlar: IL-4 ve IL-13 gibi antiinflamatuar sitokinlerin eklenmesiyle indüklenebilir.
Bu yöntemler araştırmacıların makrofajların çeşitli biyolojik işlevlerini ve patolojik koşullar altında davranışlarını in vitro incelemelerine olanak tanır. Her adımın özel çalışma koşulları (hücre yoğunluğu, kültür süresi, eklenen faktörlerin konsantrasyonu vb.) deneyin özel amacına göre optimize edilmesi gerekebilir.
Tablo 1.Makrofaj kültürü ve indüksiyon koşulları
| Hücre kaynağı | Kültür ortamı | İlk Eklenenler | M1 polarizasyonu | M2 polarizasyonu |
| THP-1Hücresi | RPMı 1640 | 100 ng/mL DİA | 20 ng/mL IFN-γ 100 ng/mL LPS | 20 ng/mL IL-4 20 ng/mL IL-13 |
| Monositler | RPMı 1640 | M1:50 ng/mL GM-CSF M2: 50 ng/mL M-CSF | 10 ng/mL LPS 50 ng/mL IFN-γ | M2a: 20 ng/mL IL-4 M2b: IgG+LPS M2c: 20 ng/mL TGF-β1 veya 10 ng/mL IL-10 |
| Mok | IMDM | 10-50 ng/mL M-CSF | 100 ng/mL LPS (50ng/mL IFN-γ eklenebilir) | 10 ng/mL IL-4 (10 ng/mL IL-13 eklenebilir) |
| RAW264.7 Hücre | DMEM | / | 100 ng/mL LPS | 20 ng/mL IL-4 (20 ng/mL IL-10 eklenebilir） |
5.Deneme Verileri
YEASEN, makrofaj araştırmalarını desteklemek amacıyla makrofaj kültürüyle ilgili bir dizi HiActive® yüksek aktiviteli sitokin ürünü sunmaktadır.
HiActive® Yüksek Aktif Sitokinler：Sitokinin yüksek aktivitesini garantilemek için her sitokinin biyolojik aktivitesi doğrulanmıştır.
Etkinlik doğrulama verileri:
Rekombinant Fare M-CSF Proteini
Figür 1. M‑NFS‑60 fare kullanılarak bir hücre çoğalma deneyinde ölçüldü miyeloid lösemi lenfoblast hücreleri. Bu etki için ED50 tipik olarak 16,74 -25,83 ng/ml'dir.
Rekombinant Fare GM-CSF Protein
Figür 2.ED50 Fare FDC-P1 hücreleri kullanılarak yapılan hücre çoğalma testi ile belirlenen değer 2,79-12,84 pg/mL'dir.
Rekombinant İnsan IL-10 Protein
Figür 3ED50, hücre çoğalması testi kullanılarak belirlendi fare MC/9 hücreleri 0,1 ng/mL'den azdır ve bu da > 1,0×10 özgül aktiviteye karşılık gelir7 IU/mg.
İlgili Ürünler
| Sınıflandırma | Türler | Kedi | Şartname |
| G-CSF | İnsan | 2 μg/10 μg/50 μg/100 μg | |
| Fare | 2 μg/ 10 μg/50 μg/100 μg/500 μg | ||
|
M-CSF | İnsan | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Fare | 10 μg/100 μg/500 μg | ||
|
GM-CSF | İnsan | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Fare | 10 mikrogram/100 μg/ 500 μg | ||
| IFN-γ | İnsan | 20 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Fare | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | ||
| IL-4 | İnsan | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Fare | 5 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-10 | İnsan | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Fare | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-13 | İnsan | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Fare | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg |
Referanslar
[1]Atri C, Guerfali FZ, Laouini D.Bulaşıcı Hastalıklar Sırasında Enflamasyonda İnsan Makrofaj Polarizasyonunun Rolü. Int J Mol Sci. 2018 19 Haziran;19(6):1801.