روش کشت سلولهای دندریتیک مشتق از مغز استخوان موش (BMDC) و انتخاب سیتوک

1. سلول های دندریتیک (DC) چیست؟

سلول های دندریتیک (DCs) موثرترین سلول های ارائه دهنده آنتی ژن (APCs) در بدن انسان هستند. DCها تنها APCهایی هستند که قادر به تحریک قوی تکثیر سلول های T ساده هستند. انواع دیگر APC (مانند مونوسیت ها، ماکروفاژها، سلول های B و غیره) فقط می توانند سلول های T فعال یا حافظه را تحریک کنند. بنابراین، سلول های DC آغازگر پاسخ های ایمنی سلول های T تطبیقی هستند و نقش بسیار مهمی در ایمنی تومور ایفا می کنند. سلول های DC مولکول های MHC-I و MHC-II را در سطح خود به شدت بیان می کنند و نشانگرهای سطحی خاصی دارند. آنها سلول های T را جذب، پردازش و تحریک می کنند تا آنتی ژن ها را فعال کنند و در نهایت جهت تمایز سلول های T را تعیین می کنند.

2. منبع دی سی

سلول های DC به مقدار بسیار کمی در بدن وجود دارند. مدت زمان زیادی طول می کشد تا مستقیماً DC از بدن جدا شود و بازده سلولی بسیار پایین است که تحقیقات و کاربرد DC را بسیار محدود می کند. با این حال، DC را می توان از سلول های پیش ساز DC در بافت های مختلف، مانند سلول های پیش ساز در مایع مغز استخوان، مونوسیت ها در خون محیطی و خون بند ناف، تمایز و القا کرد.

برای انسان، از آنجایی که خون محیطی انسان راحت‌ترین و دارای بیشترین تعداد مونوسیت است، متداول‌ترین روش القای DC از سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی انسان (PBMC) است. برای موش‌ها، رایج‌ترین روش القای DC از سلول‌های مغز استخوان، یعنی سلول‌های دندریتیک مشتق از مغز استخوان (BMDC) است.

شکل 1. نمودار شماتیک روش کلاسیک آماده سازی BMDC

3. روش تهیه BMDC

روش های متداول برای تهیه BMDC های موش عبارتند از:

3.1 روش کشت کلاسیک BMDC - روش Inaba (اصلاح شده)

3.2 آماده سازی در مقیاس بزرگ روش BMDC - Sons

3.3 تهیه BMDC - روش لوتز در مقیاس بزرگ

3.1 [روش کشت کلاسیک BMDC] - روش Inaba (بهبود)

【پس زمینه】

الف تعداد BMDCهای بدست آمده با روش اینابا 5-7*10 می باشد⁶/موس؛

ب روش اصلی Inaba فقط از GM-CSF برای القای تولید BMDCها استفاده می کند. اگرچه BMDCهای به دست آمده دارای توانایی تحریک قوی در واکنش لنفوسیتی مخلوط هستند، بلوغ DCها به خوبی القای ترکیبی GM-CSF+IL-4 نیست. بنابراین، روش بهبود یافته بعدی اغلب از القای ترکیبی GM-CSF+IL-4 استفاده می کند.

【مراحل کشت】

3.1.1 به دست آوردن سلول های مغز استخوان موش

1) موش های 6 تا 10 هفته ای با دررفتگی دهانه رحم کشته شدند، تمام استخوان های ران و استخوان درشت نی با جراحی برداشته شد و بافت عضلانی اطراف استخوان ها تا حد امکان با قیچی و فورسپس برداشته شد.

[توجه داشته باشید] به استخوان ها آسیب ندهید.

2) استخوان را به نیمکت تمیز منتقل کرده و در ظرف کشت استریل حاوی الکل 70 درصد به مدت 2 تا 5 دقیقه قرار دهید تا ضدعفونی و استریل شود سپس آن را دو بار با PBS استریل بشویید.

3) استخوان را به یک ظرف کشت جدید دیگر حاوی PBS منتقل کنید، دو سر استخوان را با قیچی ببرید و سپس از یک سرنگ برای استخراج PBS استفاده کنید. سوزن را از هر دو انتهای استخوان داخل حفره مغز استخوان فرو کنید و به طور مکرر مغز استخوان را داخل ظرف کشت بشویید تا استخوان کاملاً سفید شود.

4) سوسپانسیون مغز استخوان را جمع آوری کنید و قطعات کوچک و بافت ماهیچه ای را با یک مش نایلونی 200 مش فیلتر کنید.

5) فیلتر را در 1200 سانتریفیوژ کنید دور در دقیقه برای 5 دقیقه و مایع رویی را دور بریزید.

6) 2 میلی لیتر آمونیوم کلرید بافر لیز گلبول قرمز (1x) اضافه کنید، سلول ها را مجدداً معلق کنید و در دمای اتاق به مدت 3- انکوبه کنید.5 دقیقه، تا 10 دقیقه

7) 10 میلی لیتر PBS اضافه کنید تا اثر بافر لیز خنثی شود، سپس در 1200 دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید. 5 دقیقه و مایع رویی را دور بریزید.

8) یک بار با PBS بشویید و سپس سلول ها را در محیط کشت RPMI1640 حاوی 10% FBS معلق کنید. سلول های مغز استخوان موش به دست آمده است.

تهیه محلول لیز گلبول قرمز کلرید آمونیوم:

الف محلول ذخیره سازی 10 برابر را به شرح زیر تهیه کنید: وزن 82.9 g NH₄کلر، 10.0 گرم KHCO₃ و 0.37 گرم سدیم₂EDTA، در 1 لیتر آب مقطر حل کنید، با 0.22 فیلتر کنید غشای فیلتر میکرومتر برای استریل کردن و نگهداری در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 6 ماه.

ب قبل از استفاده، محلول ذخیره سازی 10 برابر را با آب مقطر استریل 1:9 تا 1 برابر محلول کاری رقیق کنید.

[توجه داشته باشید] از آنجایی که محلول لیز گلبول قرمز کلرید آمونیوم اثر مضر خاصی بر سلول های مغز استخوان دارد، زمان همولیز باید تا حد امکان کوتاه شود.

3.1.2 القای تمایز BMDC

1) سلول های مغز استخوان موش به دست آمده در مرحله 1 را بشمارید و غلظت سلول را روی 0.5-1×10 تنظیم کنید.⁶/ml با محیط کشت کامل RPMI 1640 حاوی 10% FBS.

2) در یک صفحه کشت 24 چاهی، 1 میلی لیتر سلول در هر چاهک قرار دهید، GM-CSF موش نوترکیب را اضافه کنید (20 نانوگرم در میلی لیتر) و IL-4 (10 نانوگرم در میلی لیترو در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد CO کشت کنید₂ دستگاه جوجه کشی این 0مین روز فرهنگ است.

【توجه داشته باشید】

الف به طور کلی، حدود 4-5x10⁷ سلول های مغز استخوان را می توان از یک موش برداشت، بنابراین حداقل 40-50 چاه از یک صفحه 24 چاهی را می توان آبکاری کرد.

ب محدوده غلظت GM-CSF و IL-4 20-50 است نانوگرم در میلی لیتر و 10-40 نانوگرم در میلی لیتربه ترتیب.

3) هر 2 روز یکبار صفحه کشت را به آرامی تکان دهید، سپس 3/4 حجم را با محیط کشت تازه جایگزین کنید و سیتوکین ها را دوباره پر کنید.

4) بین روزهای 5 و 8، محیط کشت را به آرامی باد بزنید تا سلول‌های معلق و سلول‌های آزاد متصل شوند.

5) سانتریفیوژ در 1200 دور در دقیقه برای 5 دقیقه و مایع رویی را دور بریزید.

6) سلول ها را در محیط کشت کامل RPMI 1640 حاوی 10% FBS معلق کنید و آنها را بشمارید، سپس غلظت سلول را روی 10×1 تنظیم کنید.⁶/ml، و GM-CSF موش نوترکیب را اضافه کنید (20 نانوگرم در میلی لیتر) و IL-4 (10 نانوگرم در میلی لیتر).

7) سلول ها را در ظروف کشت 100 میلی متری (حداکثر 10 میلی لیتر در هر ظرف) یا صفحات کشت 6 چاهی (2 متر در چاه) قرار دهید.

8) به کشت در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5% CO ادامه دهید₂ انکوباتور به مدت 1-2 روز.

9) سلول های معلق را که BMDC های بالغ تری هستند، جمع آوری کنید.

【توجه داشته باشید】

الف مراحل 2.5-2.8 مراحل آبکاری مجدد هستند که هدف آنها بالغ کردن BMDC به دست آمده در مرحله 2.4 است.

ب در عرض 3 ساعت پس از پوشش مجدد، بسیاری از سلول‌های چسبنده خاردار را می‌توان مشاهده کرد که از خوشه‌های DC مهاجرت می‌کنند و پس از 1 روز از کشت، این سلول‌های چسبنده از پایین صفحه کشت جدا شده‌اند و بسیاری از DC‌های معمولی را می‌توان در محیط کشت شناور مشاهده کرد.

3.1.3 بلوغ کامل BMDC

[توجه] BMDCهای بدست آمده در مرحله 2 DCهای کاملا بالغ نیستند. اگر می‌خواهید DCهای کاملاً بالغ به دست آورید، هنوز باید توسط LPS، CD40L یا TNF-a القا شوید.

1) BMDC بدست آمده در مرحله 2.4 یا 2.9 را در 1200 سانتریفیوژ کنید دور در دقیقه برای 5 دقیقه و مایع رویی را دور بریزید.

2) رسوب را مجدداً با محیط کشت کامل RPMI حاوی GM-CSF موش نوترکیب معلق کنید (20 نانوگرم در میلی لیتر) و IL-4 (10 نانوگرم در میلی لیتر) و غلظت سلول را روی 1×10 تنظیم کنید⁶/ml پس از شمارش.

3) به صفحات کشت 24 چاهی اضافه کنید و محرک های بلوغ مانند TNF-α را اضافه کنید (250 U/ml)، LPS (1 میکروگرم بر میلی لیتر)، یا CD40L (1 میکروگرم بر میلی لیتر).

4) کشت در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5٪ CO₂ دستگاه جوجه کشی به مدت 2 روز

5) سلول‌های معلق و سلول‌هایی را که به صورت آزادانه به دیواره متصل هستند، که سلول‌های دندریتی بالغ هستند، جمع آوری کنید.

3.2【روش تولید انبوه BMDC】-روش پسر

【پس زمینه】

الف این روش می تواند 30-40×10 بدست آورد⁶ DC/موس در عرض 7 روز که 7-10 برابر روش کلاسیک Inaba است. پس از اینکه DC از طریق گرادیان متریزامید 14.5٪ سانتریفیوژ شد، خلوص (یعنی سلول های CD11c+/I-Ab+) می تواند به 85-95٪ برسد.

ب توانایی اندوسیتوز DC بدست آمده با این روش نسبت به روش کلاسیک Inaba ضعیف تر است، اما میزان ترشح IL-12p70 مشابه است.

ج DC بدست آمده با این روش در واکنش لنفوسیتی مخلوط نسبت به روش کلاسیک Inaba دارای توانایی تحریک قوی تری است.

د DC بدست آمده با این روش می تواند پاسخ سلول T اختصاصی قوی تری را القا کند.

ه. به طور خلاصه، روش Son می‌تواند BMDC بالغ‌تر و بالغ‌تری نسبت به روش کلاسیک به دست آورد.

【مراحل کشت】

3.2.1 به دست آوردن سلول های مغز استخوان موش

مراحل مربوطه را در روش اینابا (اصلاح شده) ببینید.

3.2.2 تهیه مقادیر زیادی BMDC

1) سلول های مغز استخوان موش به دست آمده در مرحله 1 را بشمارید و غلظت سلول را روی 2×10 تنظیم کنید.⁵/ml با محیط کشت کامل RPMI 1640 حاوی 10% FBS.

2) در بشقاب های کشت 6 چاهی، سلول های 5 میلی لیتری در هر چاه پخش کنید، GM-CSF موش نوترکیب را اضافه کنید (1000 U/ml) و IL-4 (1000 U/mlو در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5 درصد CO کشت کنید₂ دستگاه جوجه کشی.

3) در روز چهارم کشت، سیستم کشت را با GM-CSF نوترکیب موش تکمیل کنید (1000 U/ml) و IL-4 (1000 U/ml).

4) DCها را در روز هفتم کشت جمع آوری کنید، با 2-4 دوباره معلق کنید میلی لیتر محیط کشت کامل RPMI 1640، به حجم مساوی 14.5% (w/v) مپانما اضافه کنید و به مدت 20 در دمای اتاق سانتریفیوژ کنید. دقیقه در 1200xg.

5) لایه میانی را جمع آوری کرده و سه بار با محیط کشت کامل RPMI 1640 برای استفاده بعدی شستشو دهید.

[یادداشت] DC در این نقطه یک BMDC نابالغ است. اگر می خواهید آن را بیشتر بالغ کنید، لطفاً به مرحله 3 بروید.

3.2.3 بلوغ کامل BMDC

1) BMDCهای جمع آوری شده در مرحله 2.4 را دوباره آبکاری کردند و GM-CSF موش نوترکیب را اضافه کردند (1000 U/ml) و IL-4 (1000 U/ml، و همچنین LPS (1-10 میکروگرم بر میلی لیتر) به نظام فرهنگ

2) کشت در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5% CO₂ انکوباتور به مدت 2 روز برای به دست آوردن BMDCهای بالغ.

3.3【روش تهیه انبوه BMDC】-روش لوتز

【پس زمینه】

الف روش لوتز مشابه روش سون است و هر دو روش می توانند BMDC را به مقدار زیاد تهیه کنند، اما روش لوتز بیشتر از روش سون استفاده می شود.

ب این روش می تواند BMDC بیشتری را تا 1-3 x 10 بدست آورد⁸ DC / ماوس، و خلوص می تواند به 90-95٪ برسد.

ج غلظت سیتوکین مورد استفاده در این روش بسیار کمتر از روش Son است و تنها 200 است U/ml، و به 30-100 کاهش می یابد U/ml از 8 تا 10 روز کشت، که می تواند تا حد زیادی در هزینه معرف صرفه جویی کند.

د بزرگترین تفاوت این روش با روش کلاسیک Inaba و روش Son این است که سلول های مغز استخوان به جای پلیت کشت سلولی در ظرف کشت باکتریایی (پتری دیش) کشت می شوند. Inaba توضیح داد که ظرف کشت باکتری برای ماکروفاژها در مغز استخوان به راحتی به دیواره نمی چسبد، در نتیجه از رشد ماکروفاژها جلوگیری می کند و از اثر بازدارندگی ماکروفاژها بر بلوغ DC جلوگیری می کند. این ممکن است دلیل اصلی این باشد که این روش می تواند تعداد زیادی از BMDCها را با تراکم آبکاری کمتر به دست آورد.

ه. با این حال، زمان کشت این روش نسبتا طولانی است و به 10-12 روز نیاز دارد. از یک طرف، این برای به دست آوردن BMDC های بیشتر است. از سوی دیگر، بیشتر گرانولوسیت‌ها و لنفوسیت‌ها به سختی می‌توانند برای چنین مدت طولانی زنده بمانند، بنابراین خلوص BMDCهای به‌دست‌آمده در نهایت می‌تواند بهبود یابد.

f. این روش فقط از GM-CSF برای کشت القایی استفاده می کند و BMDCهای به دست آمده حاوی DCهای نابالغ و بالغ هستند. برای بهبود بیشتر بلوغ، LPS یا TNF-α باید برای 1-2 روز دیگر از القاء استفاده شود و محتوای سلول های DC بالغ به 50-70٪ می رسد.

【مراحل کشت】

3.3.1 به دست آوردن سلول های مغز استخوان موش

مراحل مربوطه را در روش اینابا (اصلاح شده) ببینید و توجه داشته باشید که مرحله همولیز باید حذف شود.

3.3.2 تهیه BMDC در مقیاس بزرگ

2) در ظروف کشت باکتریایی 100 میلی متری (پتری دیش)، سلول های 10 میلی لیتری در هر ظرف پخش کنید و GM-CSF موش نوترکیب (200) را اضافه کنید. U/ml) و کشت در 37 ℃، انکوباتور CO2 5٪.

[یادداشت] در اینجا از ظروف کشت باکتری استفاده می شود نه از صفحات کشت سلولی.

3) در روز سوم 10 میلی لیتر محیط کشت کامل حاوی 20 به آن اضافه کنید نانوگرم در میلی لیتر GM-CSF موش نوترکیب به ظرف کشت.

4) در روزهای ششم و هشتم، نیمی از محیط را عوض کنید، یعنی محیط کشت قدیمی را جمع آوری کنید، گلوله سلولی را مجدداً با محیط کشت کامل حاوی 20 معلق کنید. نانوگرم در میلی لیتر موش نوترکیب GM-CSF پس از سانتریفیوژ کردن، و سپس سوسپانسیون سلولی را در ظرف اصلی قرار دهید.

5) در روز دهم می توان سلول ها را که BMDC هستند جمع آوری کرد.

3.3.3 بلوغ کامل BMDCها

1) سلولهای معلق را با دمیدن آرام DCها در روز دهم با پیپت جمع آوری کنید و در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه در 300xg سانتریفیوژ کنید.

2) مایع رویی را دور بیندازید، گلوله سلولی را با 10 میلی لیتر محیط کشت کامل RPMI 1640 مجدداً معلق کنید و سپس آن را روی یک صفحه کشت سلولی 100 میلی متری پخش کنید.

3) اضافه کردن موش نوترکیب GM-CSF (100 U/ml) و TNF-α (500 U/ml، یا موش نوترکیب GM-CSF (100 U/ml) و LPS (1 میکروگرم در میلی لیتر)؛

4) کشت را در دمای 37 درجه سانتیگراد، 5% CO ادامه دهید₂ انکوباتور برای 1-2 روز.

4. شناسایی BMDCها

ل مشاهدات مورفولوژیکی: بیشتر BMDC ها در کلنی ها رشد می کنند و سلول ها دارای برجستگی های دندریتیک متعددی هستند که در BMDC های بالغ آشکارتر است.

ل تجزیه و تحلیل فنوتیپ سلولی: از فلوسیتومتری برای تشخیص بیان مولکول های CD11c، CD40، CD80، CD86، MHC کلاس II (IA/IE) بر روی سطح سلول های DC استفاده شد. BMDC ها این مولکول ها را به شدت بیان می کنند و بیان این مولکول ها در BMDC های کاملا بالغ بیشتر افزایش می یابد.

ل واکنش لنفوسیتی مختلط (MLR): BMDCها توانایی تحریک قوی دارند و هر چه بلوغ بالاتر باشد، توانایی تحریک قوی‌تر است.

5. چگونه یک محرک بلوغ انتخاب کنیم؟

LPS، CD40L و TNF-α معمولاً از القاء کننده بلوغ مؤثر برای DC انسان و موش استفاده می شود. TNF-a ضعیف ترین توانایی را برای القای بلوغ DC در بین این سه دارد. LPS و CD40L هر دو القاء کننده قوی برای بلوغ کامل DC در شرایط آزمایشگاهی هستند. بلوغ DC القا شده توسط هر دو مشابه است، اما طیف سیتوکین القایی متفاوت است. BMDC بالغ ناشی از CD40L قوی ترین توانایی تنظیم ایمنی را در داخل بدن نشان می دهد، از جمله تولید پاسخ های ایمنی تومور محافظ و درمانی. غلظت مورد استفاده برای تحریک بلوغ کامل DC با LPS معمولاً 1-10 است میکروگرم در میلی لیتر، اما در واقع 0.1 میکروگرم در میلی لیتر اثر بسیار قوی دارد، اما برای اهداف بیمه، 1 میکروگرم در میلی لیتر به طور کلی استفاده می شود. لازم به ذکر است که مولکول های CD40L متعلق به خانواده لیگاندهای TNF هستند که مشخصه آن این است که آنها فقط پس از تشکیل تریمرها می توانند عمل کنند. بنابراین بهتر است برای تحریک DC از پروتئین تریمر نوترکیب CD40L استفاده شود که تاثیر خوبی خواهد داشت. اگر از مونومرهای CD40L برای تحریک DC استفاده شود، بلوغ در اکثر موارد زیاد نیست.

6. انتخاب روش آموزش

جدول 1.مقایسه سه روش تجربی رایج برای تهیه BMDC

پارامتر	روش کشت کلاسیک BMDC - روش Inaba	تهیه در مقیاس بزرگ BMDC - روش Son	تهیه در مقیاس بزرگ BMDC - روش لوتز
تعداد نقل قول ها در PubMed	783	24	663
همولیز مغز استخوان، لیز گلبول های قرمز	بله	بله	خیر
مغز استخوان ابتدا لنفوسیت ها را حذف می کند	بله	خیر	خیر
حذف گرانولوسیت ها در طی کشت	بله	خیر	خیر
حجم آبکاری اولیه سلول های مغز استخوان	1 میلی لیتر	15 میلی لیتر	10 میلی لیتر
دستگاه جوجه کشی	صفحات کشت سلولی 24 چاهی	صفحه کشت سلولی 6 چاهی	ظرف 100 میلی متری کشت باکتری
محیط کشت	RPMI 1640 + 10% FCS
غلظت GM-CSF موش	200-1000 U/ml	غلظت اولیه اضافه شده 125-1000 است U/ml در روزهای چهارم و هفتم، مقادیر کافی GM-CSF و IL-4 به سیستم کشت اضافه می شود.	غلظت اولیه اضافه شده 200 است U/ml.3-100 U/ml بعد از روز دهم
ماوس IL-4	نیاز نیست	نیاز،غلظت همان GM-CSF است	نیاز نیست
روش تبادل سیال	در روز دوم و چهارم، 50 تا 75 درصد از محیط کشت قدیمی (که حاوی سلول است) را دور بریزید و با محیط کشت کامل تازه حاوی GM-CSF کافی جایگزین کنید.	/	در روز سوم، حجم مساوی از محیط کشت کامل حاوی GM-CSF اضافه شد. در روزهای ششم، هشتم و دهم نیمی از مدیوم تعویض شد. محیط کشت قدیمی (حاوی سلولها) آسپیره، سانتریفیوژ و در محیط کشت کامل تازه حاوی GM-CSF معلق شد و سپس دوباره قرار داده شد.
زمان کشت قبل از عبور (بسط)	6 روز	7 روز	10 روز
زمان کشت پس از گذشت (بلوغ)	2 روز	هیچ کدام	1-2 روز
القا کننده بلوغ کامل	TNF-ɑ(250 U/ml)	LPS (1-10 میکروگرم بر میلی لیتر)	TNF-ɑ(250 U/ml)یا LPS(1 میکروگرم بر میلی لیتر)
زمان برداشت سلول DC	7-8 روز	7-8 روز	10-13 روز
خلوص DC	روز 8：60-70٪	روز 7：85-95٪	روز 10-12：80-90٪
تولید DC/موس	(5-7)×10⁶	(3-4)×10⁷	(1-3)×10⁸

7. معرفهای کشت DC توصیه شده

نام محصول	گربه	اندازه
موس GM-CSF	91108ES	5 میکروگرم/50 میکروگرم/100 میکروگرم/500 میکروگرم
ماوس IL-4	90144ES	5 میکروگرم/50 میکروگرم/100 میکروگرم/500 میکروگرم
موس TNF-α	90621ES	5 میکروگرم/20 میکروگرم/50 میکروگرم/500 میکروگرم
ماوس CD40L Trimer Protein	94016ES	25 میکروگرم/100 میکروگرم/500 میکروگرم

مقاله قبلی مقاله بعدی