با توسعه سریع صروتئین سعلم، فناوری تصفیه پروتئین نقش مهمی در زمینه تحقیقات بیولوژیکی و صنعت بیوتکنولوژی دارد. به عنوان یک تکنیک اصلی، این شامل ادغام اطلاعات کدکننده پروتئین هدف به سلول‌های میزبان از طریق روش‌های مهندسی ژنتیک است، به طوری که می‌توان آن‌ها را وادار به تولید موثر پروتئین‌های مورد نیاز کرد. متعاقبا، یک سری مراحل عملیاتی پیچیده در شرایط آزمایشگاهی برای دستیابی به استخراج با خلوص بالا از پروتئین ها انجام می شود. خالص‌سازی پروتئین دانشمندان را قادر می‌سازد تا انواع مختلفی از پروتئین‌ها را جدا کنند، که برای مطالعات عمیق در مورد ساختار و عملکرد پروتئین‌ها، توسعه داروهای جدید، تشخیص بیماری‌ها و ارتقای کاربرد بیوتکنولوژی بسیار مهم است. این فناوری نه تنها صحت آزمایش های علمی را تضمین می کند، بلکه به طور مداوم توسعه علوم زیستی را پیش می برد.
شکل 1. نمودار شماتیک کروماتوگرافی میل ترکیبی[1]
در زمینه مهندسی پروتئین، تگ های همجوشی به عنوان یک ابزار قدرتمند عمل می کنند که می تواند اهداف آزمایشی مختلف را با اتصال به پروتئین های هدف تسهیل کند. توابع تگ های همجوشی رایج برای مرجع در جدول زیر ذکر شده است. با این حال، هنگامی که این برچسب‌ها پس از انجام عملکردهای کمکی اولیه خود روی پروتئین‌های همجوشی باقی می‌مانند، ممکن است اثرات نامطلوبی بر آزمایش‌های بعدی داشته باشند، مانند تداخل با آزمایش‌های ایمونولوژیک حیوانات یا تأثیر بر فعالیت بیولوژیکی پروتئین‌ها. بنابراین، حذف این برچسب های همجوشی غیر ضروری برای اطمینان از عملکرد طبیعی پروتئین ها و دقت آزمایش ها بسیار مهم است.
جدول 1. مقدمه ای بر عملکرد برچسب های همجوشی رایج و روش های برش آنزیمی
| تگ فیوژن | اندازه (KDالف) | تابع | روش های متداول برش آنزیمی |
| او | 0.84 | مفید برای خالص سازی، قادر به خالص سازی پروتئین های محلول/شامل بدن است. | پروتئاز TEV |
| پرچم | 1.01 | پروتئین هدف ذوب شده با Fتاخیر برچسب را می توان توسط آنتی بادی علیه F شناسایی کردتاخیربه طوری که پروتئین فیوژن حاوی Fتاخیر برچسب را می توان با وسترن بلات، الایزا و روش های دیگر شناسایی و شناسایی کرد. | انتروکیناز |
| GST | 26 | حلالیت پروتئین را افزایش می دهد، تنها قادر به خالص سازی پروتئین های محلول و محافظت از پروتئین های سمی است. | ترومبین |
| MBP | 44.4 | افزایش حلالیت پروتئین و از پروتئین های سمی محافظت می کند. | پروتئاز TEV |
| NusA | 55 | افزایش حلالیت پروتئین و از پروتئین های سمی محافظت می کند. | ترومبین |
| SUMO | 11.2 | افزایش حلالیت پروتئین ها، ترویج پروتئین از پروتئولیتیک هیدرولیز، و بهبود پایداری پروتئین ها. | SUMO پروتئاز |
امروز، ما خوشحالیم که محصولی پیشرفته برای حذف موثر و دقیق برچسب های فیوژن - UCF.ME به شما معرفی کنیم.TM پروتئاز rTEV این آنزیم با روش آزمایشی ساده و آسان خود می تواند به راحتی برچسب های غیر ضروری را از پروتئین های همجوشی جدا کند و در نتیجه پروتئین های هدف با خلوص بالا را به دست آورد.
UCF.METM پروتئاز rTEV
TEV Protease یک پروتئاز است که به طور گسترده برای برش برچسب های همجوشی پروتئین نوترکیب استفاده می شود که به دلیل ویژگی بالای سایت شناخته شده است. توالی هفت آمینو اسید EXXYXQ↓(G/S) را کاملاً تشخیص می‌دهد و بین گلوتامین و گلیسین یا سرین جداسازی دقیقی انجام می‌دهد. رایج ترین توالی هفت آمینو اسیدی Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly است. این ویژگی دقت و کارایی در فرآیند پردازش پروتئین را تضمین می کند.
شکل 2. نمودار شماتیک مکانیسم عمل پروتئاز TEV[2]
UCF.METM پروتئاز rTEV یک پروتئاز نوترکیب است که مهندسی ژنتیکی شده و به خوبی خالص شده است. این نه تنها فعالیت عملکردی کامل آنزیم TEV طبیعی را حفظ می کند، بلکه ثبات و ویژگی عالی را در محدوده دمایی وسیع تری نشان می دهد. را باقیمانده gDNA میزبان از tمحصول او است خیلی پایین، اطمینان از راندمان برش بالاتر برچسب های همجوشی پروتئین در کاربردهای عملی و به طور موثر کاهش خطر معرفی باقی مانده های مواد برون زا. UCF.METM پروتئاز rTEV در شرایط pH 7.0 و 30 درجه سانتیگراد فعالیت مطلوبی را نشان می دهد. با این حال، حتی تحت طیف گسترده ای از شرایط با pH 6.0-8.5 و دمای 4-30 درجه سانتیگراد، فعالیت خود را حفظ می کند تا نیازهای مختلف پردازش پروتئین را برآورده کند. شایان ذکر است که UCF.METM پروتئاز rTEV دارای یک برچسب 6×His در انتهای N است که می تواند به طور موثر توسط رزین Ni-NTA حذف شود و در نتیجه خالص سازی دقیق پروتئین هدف حاصل شود.
نمایش عملکرد
1. راندمان برش بالا: برچسب پروتئین با دقت بیشتری بریده می شود
با استفاده از پروتئین فیوژن (3 میکروگرم) حاوی UCF.METM محل برش پروتئاز rTEV به عنوان بستر، UCF.METM پروتئاز rTEV در 10، 5 و 3 U به ترتیب اضافه شد و واکنش در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 1 ساعت انجام شد. اثر برش توسط الکتروفورز ژل آگارز تشخیص داده شد. نتایج نشان داد که YسهولتUCF.METM پروتئاز rTEV زمانی که مقدار ورودی بیش از 3 U بود، با راندمان برش بیش از 90 درصد، می‌توانست بستر را به طور موثر برش دهد.
شکل 3. تأیید فعالیت برش UCF.METM پروتئاز rTEV
2. باقیمانده gDNA میزبان کم: به طور موثر خطر ورود بقایای مواد اگزوژن را کاهش می دهد.
با تست هاست (E. coli) باقیمانده های gDNA در دسته های مختلف UCF.METM rTEV پروتئاز، نتایج نشان داد که باقیمانده gDNA میزبان UCF.METM پروتئاز rTEV بسیار کمتر از 1 کپی/U بود.
شکل 4. نتایج باقیمانده gDNA میزبان در UCF.METM پروتئاز rTEV
3. شرایط کاربرد گسترده: قادر به برآوردن نیازهای مختلف پردازش پروتئین است.
با تأیید فعالیت برش UCF.METM پروتئاز rTEV تحت شرایط مختلف، نتایج نشان داد که UCF.METM پروتئاز rTEV تحت شرایط 4-30 درجه سانتیگراد فعالیت قوی داشت که می توانست نیازهای کاربردی مختلف مشتریان را برآورده کند.
| زمان واکنش (ساعت) | فعالیت برش در دماهای مختلف (%) | |||
| 4℃ | 16 درجه سانتیگراد | 21 درجه سانتیگراد | 30 درجه سانتیگراد | |
| 1 | 34 | 58 | 56 | 85 |
| 2 | 58 | 80 | 78 | 90 |
| 3 | 71 | 99 | 99 | 99 |
| 3.5 | 84 | 99 | 99 | 99 |
Yسهولتمحصولات پروتئینی برش برچسب فیوژن توصیه می شود
| محصول نام | محصول نعجب | |
| TEV پروتئاز | UCF.METM پروتئاز rTEV | 20427ES |
| انتروکیناز | انتروکیناز، نوترکیب | 20395ES |
| SUMO پروتئاز | SUMO پروتئاز | 20410ES |
| پروتئاز 3C | پروتئاز 3C | 20409ES |
مراجع：
[1] Parikh I, Cuatrecasas P. Affinity Chromatography[J].Vox Sanguinis, 1972, 23(1-2):141-146.DOI:10.1159/000466530.
[2] Paththamperuma C، Page R C. سنجش رفع فلورسانس برای فعالیت TEV پروتئاز [J]. بیوشیمی تحلیلی، 2022، 659: 114954.