Ingin mengendalikan pertumbuhan tumor pada tikus telanjang secara real time? Apakah Anda ingin mengetahui lokasi kolonisasi sel pada tikus? Ingin mengetahui efek pengobatan obat pada tumor dalam kehidupanHal ini dapat dicapai dengan memasang pelacak pada sel, yang memungkinkan Anda mengontrol lokasi dan jumlah sel kapan saja. Teknologi ini adalah teknologi "deteksi" pencitraan in vivo. Jadi, apa itu teknologi pencitraan in vivo?

1. Apa itu teknologi pencitraan in vivo?
2. Karakteristik pencitraan luciferase
3. Arah aplikasi pencitraan luciferase
4. Berbagi contoh percobaan
5. Tanya Jawab
6. Informasi produk
7. Mengenai membaca

1. Apa itu teknologi pencitraan in vivo?

Sejak tahun 1999, Dr. Weissleder dari Universitas Harvard di Amerika Serikat mengusulkan konsep pencitraan molekuler, yaitu menggunakan metode pencitraan untuk melakukan penelitian kualitatif dan kuantitatif tentang proses biologis in vivo pada tingkat seluler dan molekuler. Pencitraan in vivo didasarkan pada pencitraan molekuler. Melalui sistem pencitraan ini, proses biologis seperti pertumbuhan dan metastasis tumor, perkembangan penyakit menular, dan ekspresi gen tertentu dapat diamati pada hewan hidup.

In vivo, pencitraan optik hewan hidup terutama mengadopsi dua teknologi: bioluminesensi dan fluoresensi. Bioluminesensi adalah gen luciferase untuk menandai sel atau DNA, sedangkan teknologi fluoresensi menggunakan gen pelapor fluoresensi seperti protein fluoresensi hijau dan protein fluoresensi merah dan fluoresensi seperti FITC, Cy5, dan Cy7. Elemen dan titik kuantum (QD) untuk pelabelan. Bioluminesensi mamalia umumnya mengintegrasikan gen luciferase kunang-kunang (terdiri dari 554 nukleotida, sekitar 50KD), yaitu gen luciferase, ke dalam DNA kromosom sel observasi yang diharapkan untuk mengekspresikan luciferase. Kemudian membudidayakan garis sel yang dapat mengekspresikan luciferase secara stabil, dan ketika sel membelah, berdiferensiasi, dan mentransfer, luciferase juga akan terus mengekspresikan secara stabil. Gen, sel, dan hewan hidup semuanya dapat ditandai dengan gen luciferase. Luciferase adalah sejenis enzim yang dapat mengkatalisis substrat untuk menghasilkan bioluminesensi. Luciferase dari berbagai sumber memiliki karakteristiknya sendiri dan dapat mengkatalisis substrat untuk memancarkan warna cahaya yang berbeda. Di antara semuanya, luciferase kunang-kunang memiliki sensitivitas tinggi dan rentang linier yang luas sebesar 7~8 orde besaran. Ini telah menjadi gen pelapor sel mamalia yang paling umum digunakan. Plasmid pelapor luciferase dipindahkan ke dalam sel, dan substratnya luciferin ditambahkan untuk menginkubasi sel. Dengan adanya ATP, O₂, dan ion magnesium, luciferase dapat mengoksidasi substrat luciferin untuk menghasilkan reaksi cahaya tampak. Wujudkan "pemasangan 'pelacak' satu kali, dan lacak serta deteksi kapan saja". Selain luciferase kunang-kunang, terkadang juga digunakan luciferase renilla. Substrat keduanya berbeda, substrat yang pertama adalah D-luciferin, dan substrat yang kedua adalah coelenterazine. Panjang gelombang pancaran cahaya keduanya berbeda, kisaran panjang gelombang cahaya yang dipancarkan oleh yang pertama adalah 540-600nm, dan kisaran panjang gelombang cahaya yang dipancarkan oleh yang terakhir adalah 460-540nm. Cahaya yang dipancarkan oleh yang pertama lebih mudah melewati jaringan, sedangkan yang terakhir dimetabolisme lebih cepat di dalam tubuh, dan spesifisitasnya tidak sebaik yang pertama. Oleh karena itu, tidak sebagian besar percobaan in vivo menggunakan luciferase kunang-kunang sebagai gen pelapor.

Gambar 1.Lokalisasi sel berlabel luciferase

Prinsip optik bioluminesensi: cahaya akan tersebar dan diserap saat merambat di jaringan mamalia, dan foton akan dibiaskan saat bertemu membran sel dan sitoplasma, dan berbagai jenis sel dan jaringan memiliki karakteristik penyerapan foton yang berbeda. Hemoglobin merupakan penyebab utama penyerapan cahaya tampak di dalam tubuh dan dapat menyerap sebagian besar pita cahaya tampak biru-hijau. Namun pada pita cahaya tampak merah yang lebih besar dari 600nm, penyerapan hemoglobin sangat kecil. Oleh karena itu, sejumlah besar cahaya dapat melewati jaringan dan kulit untuk dideteksi di daerah kemerahan. Setidaknya beberapa ratus sel subkutan dapat dideteksi menggunakan teknologi pencitraan bioluminesensi hewan hidup. Namun, tergantung pada kedalaman sumber cahaya pada tikus, jumlah minimum sel yang dapat dilihat bervariasi. Secara umum, untuk setiap peningkatan 1 cm, intensitas cahaya berkurang 10 kali lipat, dan redaman lebih banyak untuk jaringan dan organ yang kaya darah, dan lebih sedikit redaman untuk jaringan dan organ yang berdekatan dengan tulang. Dalam kasus kedalaman yang sama, intensitas cahaya yang terdeteksi memiliki hubungan linear yang signifikan dengan jumlah sel, dan intensitas cahaya yang terdeteksi dapat diukur oleh instrumen untuk mencerminkan jumlah sel.

Gambar 2. Prinsip luminescent reaksi luciferase dan garam kalium luciferin

Berbeda dengan bioluminesensi, teknologi fluoresensi menggunakan gen pelapor fluoresensi atau pewarna fluoresensi (termasuk bahan pelabelan nano baru seperti titik kuantum fluoresensi) untuk pelabelan. Dengan menggunakan fluoresensi dari gen pelapor, protein fluoresensi, atau pewarna, sumber cahaya biologis in vivo dapat dibuat. Bioluminesensi adalah autofluoresensi pada hewan tanpa sumber cahaya eksitasi, sedangkan fluoresensi memerlukan eksitasi oleh sumber cahaya eksitasi eksternal sebelum dapat dideteksi oleh sistem pencitraan. Label fluoresensi digunakan secara luas, termasuk pada hewan, sel, mikroorganisme, antibodi, obat-obatan, nanomaterial, dll.

2. Karakteristik pencitraan luciferase

◎ tidak ada radiasi, hampir tidak berbahaya bagi organisme.

◎ bioluminesensi tanpa sumber cahaya eksitasi.

◎ sensitivitas tinggi, ratusan sel dapat dideteksi.

◎ daya tembus yang baik, kedalaman jaringan 3-4 cm masih dapat dideteksi.

◎ rasio sinyal terhadap derau tinggi, sinyal fluoresensi kuat, dan anti-interferensi yang baik.

3. Arah aplikasi pencitraan luciferase

3.1 Pertumbuhan tumor

Dalam percobaan tumorigenesis pada tikus telanjang, pertumbuhan tumor diamati secara langsung tanpa invasi, dan tidak perlu mengupas tumor untuk pengukuran.

3.2 Obat onkologi

Pengaruh pemberian pada pertumbuhan tumor atau metastasis terdeteksi, dan substrat fluorescein dapat dihilangkan dalam waktu 3 jam, tanpa mengganggu percobaan obat.

3.3 Lokalisasi sel

Lokalisasi dan distribusi sel asing pada hewan terdeteksi.

3.4 Pengaturan ekspresi gen

Gen target atau promotor gen target digabungkan dengan gen luciferase untuk mendeteksi perubahan ekspresi gen selama perawatan obat atau perjalanan penyakit.

3.5 Penelitian sel induk

Pemantauan transplantasi, kelangsungan hidup, dan proliferasi sel punca; Penelusuran distribusi dan migrasi sel punca dalam kehidupan.

4. Percobaan contoh membagikan

Gambar 3. dalam kehidupan deteksi pencitraan efek terapi CAR-MUC1 T/MOBIL-MUC1-IL22 Sel T pada pembentukan tumor dengan injeksi subkutan sel HN4 di tikus^[1].

Gambar 4. Setelah sel HUC-MSCs disuntikkan ke otot rangka tikus, lokalisasi sel dideteksi dengan dalam kehidupan pencitraan (ditandai dengan panah merah)^[2].

Gambar 5. Kemampuan dalam kehidupan pencitraan untuk mendeteksi migrasi sel punca mesenkimal (MSC) ke lokasi luka bakar. Sel punca mesenkimal (MSC/FLuc) disuntikkan secara intravena ke dalam model luka bakar punggung tikus. Empat hari setelah penyuntikan, sinyal bioluminesensi muncul di lokasi luka bakar, lalu berangsur-angsur berkurang (panah merah menunjukkan lokasi luka bakar)^[3].

5. Tanya Jawab

Q1: Dibandingkan dengan teknologi tradisional, apa kelebihan teknologi pencitraan bioluminesensi?

Dibandingkan dengan teknologi tradisional, teknologi ini lebih sensitif daripada metode tradisional dalam penelitian metastasis tumor, terapi gen, epidemiologi, pelacakan sel punca, leukemia, dan penelitian terkait lainnya. Teknologi ini juga dapat mempelajari patogenesis dan penyaringan obat penyakit terkait secara cepat dan intuitif melalui serangkaian model penyakit hewan transgenik.

Q2: Bagaimana cara memberi label sel punca dengan gen luciferase?

Gen yang diekspresikan secara konstitutif dapat diberi label untuk membuat tikus transgenik, dan sel induk diberi label. Sel induk hematopoietik diambil dari sumsum tulang tikus dan ditransplantasikan ke sumsum tulang tikus lain. Teknologi ini dapat digunakan untuk melacak proliferasi, diferensiasi, dan migrasi sel induk hematopoietik dalam tubuh. Metode lain adalah memberi label sel induk dengan lentivirus.

Q3: Berapa lama waktu yang tepat untuk melakukan pengujian setelah penyuntikan fluorescein, dan berapa lama pendaran cahayanya dapat bertahan?

Umumnya, sinyal fluoresensi mencapai periode stabil terkuat setelah injeksi intraperitoneal selama 10-15 menit dan mulai menurun setelah 20-30 menit. Setelah 3 jam, fluorescein hilang dan pendaran cahaya menghilang sepenuhnya.

Q4: Bagaimana cara menyuntikkan fluorescein ke tikus? Apa perbedaan antara metode penyuntikan?

Fluorescein dapat disuntikkan ke tikus melalui suntikan intraperitoneal atau suntikan vena ekor. Zat ini dapat menyebar ke seluruh tubuh tikus dalam waktu sekitar 1 menit. Dalam kebanyakan kasus, konsentrasi fluorescein adalah 150 mg/kg. Untuk tikus seberat 20 g, sekitar 3 mg fluorescein dapat digunakan. Untuk suntikan intraperitoneal, difusi berlangsung lambat, pendaran cahaya awal berlangsung lambat, dan waktu pendaran cahaya berkelanjutan berlangsung lama. Untuk suntikan fluorescein ke vena ekor, zat ini berdifusi dengan cepat dan mulai memancarkan cahaya dengan cepat, tetapi durasi pendarannya singkat.

6.Informasi produk

Yeasen adalah perusahaan bioteknologi yang bergerak dalam penelitian, pengembangan, produksi, dan penjualan tiga reagen biologis utama: molekul, protein, dan sel. Produk yang disediakan oleh Yeasen adalah sebagai berikut.

Tabel 1. Informasi produk

7. Mengenai membaca

Sistem deteksi gen pelapor luciferase generasi baru——Lebih mudah, lebih sensitif, lebih tepat