Apa itu Aureobasidin A?
Aureobasidin A (AbA) adalah antibiotik peptida siklik yang diisolasi dari jamur berfilamen Aureobasidium pullulans No. R106, yang memiliki sifat antijamur yang kuat dan dapat bersifat toksik bagi ragi pada konsentrasi rendah (0,1-0,5 μg/mL). Mekanisme kerja AbA adalah melalui penghambatan aktivitas inositol phosphorylceramide synthase (IPC synthase), enzim yang dikodekan oleh gen AUR1 pada ragi, yang menghalangi sintesis dari ceramide menjadi inositol fosfolipid, yang menyebabkan defisiensi sphingolipid, pecahnya membran sel, dan dengan demikian membunuh strain tersebut. Spesies jamur yang sensitif terhadap AbA meliputi Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans, dan A. niger.
Gambar 1 Rumus struktur AbA, CAS#127785-64-2
Penelitian telah menemukan bahwa gen AUR1 dari Saccharomyces cerevisiae dan gen AURA dari Aspergillus nidulans bersifat homolog, keduanya mengkode sintase IPC. Oleh karena itu, mutasi pada kedua gen ini dapat memberikan resistensi AbA yang kuat terhadap galur, seperti gen AUR1-C yang bermutasi. AbA sangat cocok sebagai penanda seleksi obat untuk menyaring klon positif, dan tidak memerlukan pengoptimalan kondisi, dengan latar belakang yang sangat rendah. Resistensi AbA juga merupakan pelapor ideal untuk studi hibrida tunggal/ganda ragi dan kompatibel dengan sistem hibrida ragi yang membawa resistensi yang sesuai.
Apa itu Sistem Hibrida Ragi Tunggal/Ganda
Sistem ragi dua-hibrida (Yeast two-hybrid assay) diciptakan oleh Fields dan Song dan yang lainnya berdasarkan karakteristik regulasi transkripsi eukariotik. Sistem ini dapat menganalisis interaksi antara protein yang diketahui dengan cepat dan langsung serta digunakan secara luas dalam studi interaksi antigen-antibodi, penemuan protein baru dan fungsi protein baru, penyaringan target obat, dan pembuatan peta keterkaitan protein genomik. Prinsip ragi dua-hibrida adalah bahwa aktivator transkripsi eukariota mengandung dua domain struktural yang berbeda: domain pengikatan DNA (DNA binding domain, DNA-BD) dan domain aktivasi transkripsi DNA (Activation domain, AD), yang dapat dipisahkan secara independen tanpa memengaruhi fungsi masing-masing. BD dan AD sendiri tidak dapat mengaktifkan respons transkripsi, hanya ketika keduanya cukup dekat secara spasial, mereka menunjukkan aktivitas aktivator transkripsi lengkap, yang memungkinkan gen hilir untuk ditranskripsi. Dengan membangun plasmid fusi dari dua protein yang diteliti (protein X dan protein Y) dengan domain BD dan AD masing-masing dan mengekspresikannya dalam sel ragi yang sama, jika tidak ada interaksi antara dua protein tersebut, gen reporter tidak akan ditranskripsi; jika dua protein berinteraksi, domain BD dan AD akan berdekatan secara spasial, sehingga gen reporter akan ditranskripsi.
Gambar 2 Diagram prinsip ragi dua hibrida [1]
Teknologi ragi satu-hibrida adalah alat untuk mempelajari interaksi asam nukleat-protein, yang dikembangkan berdasarkan ragi dua-hibrida, dan digunakan secara luas untuk mempelajari regulasi ekspresi gen dalam sel eukariotik, seperti mengidentifikasi apakah ada interaksi antara DNA yang diketahui dan protein yang diketahui; mengisolasi protein baru yang mengikat elemen pengatur cis target atau tempat pengikatan DNA pendek lainnya; secara akurat menemukan tempat pengikatan DNA yang telah terbukti berinteraksi dan menganalisis domain pengikatan DNA protein. Prinsip dasarnya adalah membangun elemen cis-acting yang diketahui di hulu promotor paling dasar (promotor minimal, Pmin) dan menghubungkan gen reporter di hilir Pmin. cDNA yang mengkode faktor transkripsi yang akan diuji digabungkan dengan vektor ekspresi domain AD ragi dan dimasukkan ke dalam sel ragi.Jika produk gen ini dapat mengikat elemen cis-acting, ia dapat mengaktifkan promotor Pmin, yang memungkinkan gen reporter diekspresikan.
Gambar 3 Diagram prinsip ragi hibrida tunggal [2]
Untuk studi hibrida tunggal/ganda ragi,
| Bstrain bakterial | mikrofon (Ngram/ml) | |
| S.cerevisiae | ATCC9763 (bersifat diploid) | 200-400 |
| SH3328 (haploid) | 100 | |
| Ragi sake (bersifat diploid) | 100-200 | |
| Ragi shochu (bersifat diploid) | 100 | |
| Ragi bir (triploid atau tetraploid) | 100 | |
| Ragi roti (bersifat diploid) | 200-400 | |
| Skizofrenia.pombe | JY-745 (monopoli) | 100 |
| Jamur albicans | TIMM-0136 (bersifat diploid) | 40 |
| C.tropicalis | TIMM-0324 (bersifat diploid) | 80 |
Kasus Aplikasi
Untuk mempelajari situs pengikatan protein GmWRKY31 pada promotor gen GmSAGT1, dalam percobaan hibrida tunggal ragi, urutan DNA target dimasukkan ke dalam vektor pBait-AbAi yang mengandung gen pelapor urasil Ura3, yang terletak di hulu gen AUR1-C. Setelah transformasi ragi dengan plasmid yang sesuai, ia disuspensikan dalam larutan NaCl 0,9%, dan OD600 disesuaikan menjadi 0,005. Selanjutnya, 100 μL sampel disebarkan pada pelat yang mengandung 500 ng/mL AbA, dibalik, dan dikultur pada suhu 30℃ selama 3-5 hari.[3].
Gambar 3 Interaksi protein GmWRKY31 dengan strain ragi yang mengandung fragmen F16, F20, F73, delF16, delF20, atau delF73.
Artikel yang diterbitkan dengan reagen kami
[1] Shunan Zhang, Yuyi Zhang, Kangning Li,, et al. Nitrogen Memmediasi Waktu Pembungaan dan Efisiensi Penggunaan Nitrogen melalui Pengatur Bunga pada Padi,Current Biology,Volume 31, Edisi 4, Tahun 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (JIKA:10.834)
[2] Jiaying Kuang, Yingchun Xu, Yidan Liu, dkk. Jaringan pengatur yang berpusat pada NnSnRK1 untuk penghentian awal pembungaan yang disebabkan oleh naungan pada teratai, Botani Lingkungan dan Eksperimental, Volume 221, 2024, 105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (JIKA:5.7)
Produk Terkait
| Nama Produk | Kucing# | Spesifikasi |
| Siprofloksasin hidroklorida | 60201ES05/25/60 | 5/25/100 gram |
| Ampisilin, Garam Natrium | 60203ES10/60 | 10/100 gram |
| Doksisiklin hidlat | 60204ES03/08/25 | 1/5/25 gram |
| Kloramfenikol, Kelas USP | 60205ES08/25/60 | 5/25/100 gram |
| Kanamisin Sulfat | 60206ES10/60 | 10/100 gram |
| Tetrasiklin HCl Tetrasiklin hidroklorida (USP) | Nomor telepon 60212ES25/60 | 25/100 gram |
| Vankomisin Hidroklorida | 60213ES60/80/90 | 100mg/1 gram/5 gram |
| Garam Sulfat Gentamycin | 60214ES03/08/25 | 1/5/25 gram |
| Spektinomisin Hidroklorida | 60215ES08 | 5 gram |
| Fleomisin (20 mg/mL dalam larutan) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Blastisidin S (Blastisidin) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nistatin | 60219ES08 | 5 gram |
| G418 Sulfat (Geneticin) | Nomor telepon 60220ES03/08 | 1/5 gram |
| Puromisin (larutan 10 mg/mL) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1/5×1/10×1/50×1 ml |
| Puromisin Dihidroklorida | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 mg / 1 gram |
| Higromisin B (50 mg/mL) | 60224ES03 | 1 gram (20ml)/10×1 gram (20ml) |
| Higromisin B | Nomor telepon 60225ES03/10 | 1/10 gram |
| Eritromisin | Nomor telepon 60228ES08/25 | 5/25 gram |
| Waktu | Nomor telepon 60230ES07/32 | 3,2/10×3.2 gram |
| Aureobasidin A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1 mg |
| Polimiksin B Sulfat | Nomor telepon 60242ES03/10 | 1/10 mililiter |
Dokumentasi referensi
[1] Paiano A, dkk. Uji Hibrida Ragi Dua untuk Mengidentifikasi Protein yang Berinteraksi.Curr Protoc Protein Sci. 2019 Februari;95(1):e70.
[2] John S, dkk. Pengujian satu hibrida ragi: perspektif historis dan teknis. Metode. Agustus 2012; 57 (4): 441-447.
[3] Dong H, dkk. Analisis transkriptom TF WRKY kedelai sebagai respons terhadap infeksi Peronospora manshurica. Genomik. 2019 Desember;111(6):1412-1422.