1 Sebuahprinsip aksi

Higromisin B adalah antibiotik aminoglikosida yang diproduksi oleh metabolisme Streptomyces hygroscopicus, yang menghambat sintesis protein dengan mengganggu translokasi dan mendorong kesalahan pembacaan ribosom 80S, sehingga membunuh sel prokariotik dan eukariotik.

Saat ini, gen ini umum digunakan untuk menyaring dan memelihara sel prokariotik atau eukariotik yang mengandung gen resistensi higromisin.

2 Aplikasi

2.1Menyaring dan memelihara kultur sel prokariotik atau eukariotik (sel tumbuhan dan sel mamalia) yang ditransfeksi secara stabil dengan Hph+vektor

Higromisin B gen resistensi (hyg atau hph) yang berasal dari Escherichia coli. mengkodekan fosfotransferase higromisin B, yang mengubah higromisin B menjadi produk terfosforilasi yang tidak aktif secara biologis, sehingga melakukan detoksifikasi. Berdasarkan prinsip ini, higromisin B merupakan penanda seleksi yang sangat berguna untuk menyaring dan memelihara kultur sel prokariotik atau eukariotik yang berhasil ditransfeksi dengan gen resistensi higromisin.

2.2Karena perbedaan dalam cara kerja, higromisin B sering digunakan dalam kombinasi dengan geneticin G418, bleomycin dan blasticidin s untuk menyaring garis sel yang ditransfeksi secara stabil dengan dua vektor berbeda.

Hygromycin B memiliki cara kerja yang berbeda dari G418 (Cat#60220ES), Bleomycin (Cat#60257ES) dan Blasticidin (Cat#60218ES), sehingga sangat cocok untuk digunakan dalam kombinasi dengan antibiotik selektif lainnya dalam percobaan seleksi ganda.

2.3 Agen Antivirus
2.4 Sebagai obat cacing, ditambahkan ke pakan ternak dan hewan dipelihara.
2.5 Penyaringan sel yang ditransfeksi secara stabil

Konsentrasi kerja higromisin B yang digunakan untuk menyaring transfektan stabil bervariasi tergantung pada jenis sel, media, kondisi pertumbuhan, dan laju metabolisme sel. Konsentrasi yang disarankan adalah 50-1000 μg/mL. Untuk penggunaan pertama sistem eksperimental, disarankan agar konsentrasi penyaringan optimal ditentukan dengan membuat kurva pembunuhan, yaitu kurva dosis-respons. Secara umum, 50-500 μg/mL untuk sel mamalia; 20-200 μg/mL untuk sel bakteri/tanaman; 200-1000 μg/mL untuk jamur.

3 Protokol

3.1 Persiapan larutan penyimpanan (50 mg/mL)

Timbang 0,5 g higromisin B dan tambahkan 10 mL 1×PBS, pH 7,4. Setelah larut sempurna, saring dengan filter 0,22 μm untuk sterilisasi. Ambil larutan yang sudah disterilkan dan simpan pada suhu -20℃.

3.2 Konsentrasi penyaringan yang umum digunakan

Konsentrasi kerja higromisin B untuk penyaringan galur stabil bervariasi menurut jenis sel, media kultur, kondisi pertumbuhan, dan laju metabolisme sel. Disarankan untuk membuat kurva pembunuhan (kurva dosis-respons) guna menentukan konsentrasi penyaringan optimal untuk pertama kalinya. Secara umum, sel mamalia: 50-500 μg/mL; Sel bakteri/tanaman: 20-200 μg/mL; Jamur: 300-1000 μg/mL.

3.3 Pembentukan kurva pembunuhan

【Catatan】Untuk menyaring lini sel yang stabil, perlu untuk menentukan konsentrasi minimum antibiotik yang mampu membunuh sel inang yang tidak ditransfeksi. Hal ini dapat dicapai dengan membuat kurva pembunuhan (kurva dosis-respons). Setidaknya lima konsentrasi harus diatur.

1) Hari ke-1: Sel-sel yang belum ditransformasi diletakkan pada pelat kultur yang sesuai dengan kepadatan sel 20-25% dan dikulturkan semalaman.【Catatan】Jumlah sel inokulasi dapat ditingkatkan untuk sel yang membutuhkan kepadatan lebih tinggi untuk mendeteksi vitalitas.

2) Atur gradien konsentrasi dalam rentang yang sesuai menurut jenis sel. Sel mamalia dapat mengatur 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL. Encerkan larutan Hygromycin B 1:10 dengan air deionisasi atau buffer PBS hingga 5 mg/mL. Kemudian encerkan larutan ke konsentrasi kerja yang sesuai menurut tabel berikut.

Konsentrasi Akhir (μg/mL)	Volume Sedang (mL)	Penambahan Volume 5 mg/mL Higromisin B (mL)
50	9.9	0.1
100	9.8	0.2
250	9.5	0.5
500	9.0	1.0
750	8.5	1.5
1000	8.0	2.0

3) Hari ke-2: Ganti dengan media yang baru disiapkan yang mengandung konsentrasi obat yang sesuai. Buat tiga sampel paralel untuk setiap konsentrasi.

4) Ganti dengan media baru yang mengandung obat setiap 3-4 hari.

5) Penghitungan sel hidup dilakukan pada siklus tetap (misalnya, setiap 2 hari) untuk menentukan konsentrasi yang tepat guna mencegah pertumbuhan sel yang tidak ditransfeksi. Pilih konsentrasi minimum yang membunuh sebagian besar sel dalam jumlah hari yang ideal (biasanya 7-10 hari), sebagai konsentrasi kerja untuk penyaringan lini sel yang stabil.

3.4 Penyaringan sel transfeksi yang stabil

1) 48 jam setelah transfeksi, sel disubkultur dengan media skrining yang mengandung higromisin B pada konsentrasi yang sesuai (langsung atau diencerkan). 【Catatan】Antibiotik bekerja paling baik pada sel yang sedang membelah secara aktif. Jika sel terlalu padat, antibiotik tidak akan membunuh sel. Pisahkan sel sedemikian rupa sehingga sel-sel tidak lebih dari 25% konfluen.

2) Ganti media penyaringan setiap 3-4 hari.

3) Ukur pembentukan koloni sel setelah 7 hari penyaringan. Pembentukan koloni mungkin memerlukan waktu seminggu atau lebih, tergantung pada jenis sel inang, transfeksi, dan efektivitas penyaringan.

4) Pilih 5-10 klon yang resistan dan pindahkan ke pelat kultur sel 35 mm, lalu kulturkan dalam media penyaringan yang mengandung obat selama 7 hari.

5) Ganti dengan media baru tanpa obat untuk kultur.

4 Properti

Higromisin B adalah bubuk putih hingga coklat kekuningan dengan bau khusus, mudah larut dalam air, metanol, etanol, dll., dan mudah membentuk garam dengan banyak asam organik dan anorganik.

5 Penyimpanan produk

Solusinya dapat disimpan langsung pada suhu 2~8℃ dan dapat disimpan selama lebih dari 6 bulan.

6 Perhatian

1) Sel-sel yang ditransfeksi dengan gen hph resistan terhadap higromisin, dan sel-sel yang ditransfeksi mengekspresikan gen tersebut secara stabil atau sementara.

2) Gen resistensi higromisin B (hyg atau hph) ditemukan pada strain lain, termasuk Streptomyces hygroscopicus dan Klebsiella pneumoniae, selain E. Coli.

7 Rekomendasi produk

Yeasen menyediakan Higromisin B dalam dua bentuk, bubuk (1 g/10 g, Cat#60225ES) dan larutan (50 mg/mL, Cat#60224ES).

Nama Produk	Kucing#	Spesifikasi
Higromisin B (50 mg/mL)	60224ES03	1 gram (20 ml)
	60224ES10	10×1 gram (20 ml)
Higromisin B	60225ES03	1 gram
	60225ES10	10 gram

8 Artikel yang diterbitkan dengan reagen kami

[1] Zhao Q, Zheng K, Ma C, dkk. PTPS Memfasilitasi S-Nitrosilasi LTBP1 yang Terkompartementalisasi dan Meningkatkan Pertumbuhan Tumor dalam Hipoksia. Sel Mol . 2020;77(1):95-107.e5. doi:10.1016/j .molcel.2019.09.018 (JIKA:14.548)

[2] Wu LY, Shang GD, Wang FX, dkk. Profil keadaan kromatin dinamis mengungkapkan peran regulasi auksin dan sitokinin dalam regenerasi tunas. Sel Pengembangan . 2022;57(4):526-542.e7. doi:10.1016/ j.devcel.2021.12.019 (JIKA:12.270)
[3] Zhang TQ, Chen Y, Wang JW. Analisis sel tunggal dari pucuk vegetatif Arabidopsis. Sel Pengembangan . 2021;56(7):1056-1074. e8. doi:10.1016/j.devcel.2021.02.021 (JIKA:12.270)
[4] Wang FX, Shang GD, Wu LY, Xu ZG, Zhao XY, Wang JW. Dinamika Aksesibilitas Kromatin dan Struktur Jaringan Pengatur Transkripsi Hirarkis untuk Embriogenesis Somatik Tanaman. Sel Pengembangan . 2020;54(6):742-757.e8. doi:10.1016/j.devcel.2020.07.003 (JIKA:10.092)

[5] Zhu GD, Yu J, Sun ZY, dkk. Pemindaian CRISPR/Cas9 di seluruh genom mengidentifikasi CARHSP1 yang bertanggung jawab atas resistensi radiasi pada glioblastoma. Penyakit Kematian Sel . 2021;12(8):724. Diterbitkan 21 Juli 2021. doi :10.1038/s41419-021-04000-3 (JIKA:8.469)
[6] Chen J, Huang Y, Tang Z, dkk. Skrining Aktivasi Transkripsi CRISPR-Cas9 Skala Genom pada Gen Terkait Resistensi Metformin pada Kanker Prostat. Biol Pengembangan Sel Depan . 2021;8:616332. Diterbitkan 26 Januari 2021. doi:10.3389/fcell.2020.616332 (JIKA:6.684)
[7] Jiang Z, Cui Z, Zhu Z, dkk. Rekayasa transporter Yarrowia lipolytica untuk produksi asam suksinat biobased yang sangat efisien dari glukosa. Bioteknologi Biofuel . 2021;14(1):145. Diterbitkan 27 Juni 2021. doi:10.1186/s13068-021-01996-w (JIKA:6.040)
[8] Liu Y, Jiang X, Cui Z, Wang Z, Qi Q, Hou J. Merekayasa ragi oleaginous Yarrowia lipolytica untuk produksi α-farnesene. Bioteknologi Biofuel . 2019;12:296. Diterbitkan 23 Desember 2019. doi:10.1186/s13068-019-1636-z (JIKA:5.452)
[9] Zhou C, Zeng Z, Suo J, dkk. Memanipulasi Faktor Transkripsi Tunggal, Ant1, Meningkatkan Akumulasi Antosianin dalam Biji Jelai. Jurnal Pertanian Pangan Kimia . 2021;69(18):5306-5317. doi:10.1021/acs.jafc.0c08147 (JIKA:5.279)

[10] Cui Z, Zheng H, Jiang Z, dkk.Identifikasi dan Karakterisasi Asal Replikasi Mitokondria untuk Ekspresi Stabil dan Episomal di Yarrowia lipolytica. Biola Sintetis ACS . 2021;10(4):826-835. doi:10.1021/acssynbio.0c00619 (JIKA:5.110)

9 Produk Terkait

Nama Produk	Kucing#	Spesifikasi
Siprofloksasin hidroklorida	60201ES05/25/60	5/25/100 gram
Ampisilin, Garam Natrium	60203ES10/60	10/100 gram
Doksisiklin hidlat	60204ES03/08/25	1/5/25 gram
Kloramfenikol, Kelas USP	60205ES08/25/60	5/25/100 gram
Kanamisin Sulfat	60206ES10/60	10/100 gram
Tetrasiklin HCl Tetrasiklin hidroklorida (USP)	Nomor telepon 60212ES25/60	25/100 gram
Vankomisin Hidroklorida	60213ES60/80/90	100mg/1 gram/5 gram
Garam Sulfat Gentamycin	60214ES03/08/25	1/5/25 gram
Spektinomisin Hidroklorida	60215ES08	5 gram
Fleomisin (20 mg/mL dalam larutan)	60217ES20/60	20/5×20mg
Blastisidin S (Blastisidin)	60218ES10/60	10/10×10mg
Nistatin	60219ES08	5 gram
G418 Sulfat (Geneticin)	Nomor telepon 60220ES03/08	1/5 gram
Puromisin (larutan 10 mg/mL)	60209ES10/50/60/76	1×1/5×1/10×1/50×1 ml
Puromisin Dihidroklorida	60210ES25/60/72/76/80	25/100/250/500 mg / 1 gram
Higromisin B (50 mg/mL)	60224ES03	1 gram (20ml)/10×1 gram (20ml)
Higromisin B	Nomor telepon 60225ES03/10	1/10 gram
Eritromisin	Nomor telepon 60228ES08/25	5/25 gram
Waktu	Nomor telepon 60230ES07/32	3,2/10×3.2 gram
Aureobasidin A (AbA)	60231ES03/08/10	1/5×1/10×1 mg
Polimiksin B Sulfat	Nomor telepon 60242ES03/10	1/10 mililiter