Apoptosis secara umum merujuk pada jenis kematian sel terprogram yang terjadi melalui pengaturan gen intraseluler dan produknya selama perkembangan sel atau di bawah aksi beberapa faktor. Apoptosis memainkan peran penting dalam perkembangan embrio dan morfogenesis, stabilitas populasi sel normal dalam jaringan, pertahanan tubuh dan respons imun, kerusakan sel dan penuaan yang disebabkan oleh penyakit atau keracunan, serta terjadinya dan perkembangan tumor, dan memiliki potensi signifikansi terapeutik.

Peristiwa dalam jalur apoptosis terjadi dalam urutan waktu, yaitu peristiwa terjadi secara berurutan, dan akhirnya mengarah pada munculnya badan apoptosis, dengan terjadinya apoptosis.

Ciri khasnya adalah sebagai berikut:

1. Apoptosis dini: perubahan struktur membran sel, eversi fosfatidilserin；

2. Apoptosis tahap awal dan menengah: kepadatan sitoplasma meningkat, potensial membran mitokondria menghilang, permeabilitas berubah, dan sitokrom C dilepaskan ke dalam sitoplasma;

3. Apoptosis akhir: transduksi sinyal apoptosis;

4. Apoptosis lanjut: DNA terdegradasi hingga ukuran fragmen 180~200bp.

Gambar 1: Kejadian dan deteksi peristiwa berurutan dalam jalur apoptosis

1. Apoptosis dini: Annexin-V/PI pewarnaan ganda (deteksi PS pada membran ekstraseluler)

Pada sel hidup normal, fosfatidilserina (PS) terletak di sisi dalam membran sel. Ketika apoptosis terjadi, membran sel berubah, dan PS berpindah dari permukaan dalam membran sel ke permukaan luar membran sel. Annexin-V adalah protein pengikat fosfolipid yang bergantung pada Ca2+ dengan berat molekul 35-36 KD, yang dapat mengikat PS dengan afinitas tinggi. Dengan menggunakan Annexin-V yang diberi label fluorescein (FITC, Alexa fluor488, dll.) sebagai probe, sel-sel apoptosis dan sel-sel hidup dapat diidentifikasi dengan flow cytometry atau mikroskop fluoresensi.

PS sel nekrotik juga akan beralih dari permukaan dalam membran sel ke permukaan luar membran sel. Annexin-V juga dapat mengenali PS pada permukaan sel nekrotik, sehingga Annexin-V tidak dapat membedakan sel nekrotik dari sel apoptotik. Selain itu, propidine iodide (PI) adalah pewarna asam nukleat, yang dapat mengikat DNA dalam sel, dan tidak dapat menembus membran sel secara keseluruhan. Membran sel sel apoptotik awal dan sel hidup masih utuh, dan pewarna PI tidak dapat memasuki sel secara bebas melalui membran sel untuk mengikat DNA, sehingga pewarna PI tidak dapat memberi label pada sel apoptotik dan sel hidup, tetapi pewarna PI dapat mengikat DNA dalam sel melalui membran sel sel nekrotik. Pewarna PI dalam sel mati akan memancarkan fluoresensi merah setelah dieksitasi oleh laser 488nm, dan akan diterima oleh saluran yang sesuai. Oleh karena itu, Annexin V dan PI dapat digunakan bersama untuk membedakan sel hidup, sel apoptotik awal, dan sel nekrotik.

Gambar 2: Analisis hasil flow cytometry setelah pewarnaan ganda annexin-v/pi

Memesan produk:

2. Apoptosis dini: pewarnaan JC-1 (deteksi perubahan potensial membran mitokondria)

Proses apoptosis sering kali disertai dengan penghancuran potensial transmembran mitokondria, yang secara luas dianggap sebagai salah satu peristiwa paling awal dalam proses kaskade apoptosis. Proses ini terjadi sebelum munculnya karakteristik apoptosis inti (konsentrasi kromatin, kerusakan DNA). Setelah potensial transmembran mitokondria runtuh, apoptosis sel menjadi ireversibel. Adanya potensial transmembran mitokondria memungkinkan beberapa pewarna fluoresensi kationik lipofilik seperti rhodamin 123, JC-1, JC-10 untuk berikatan dengan matriks mitokondria. Peningkatan atau penurunan fluoresensinya menunjukkan peningkatan atau penurunan elektronegativitas membran dalam mitokondria.

JC-1 digunakan secara luas untuk mendeteksi potensial membran mitokondria △ΨM, yang menunjukkan akumulasi yang bergantung pada potensial dalam mitokondria. Dalam mitokondria normal, JC-1 agregat dalam matriks mitokondria untuk membentuk polimer, yang memancarkan fluoresensi merah kuat (ex=585 nm, em=590 nm); Pada sel apoptosis, potensial transmembran mitokondria terdepolarisasi, JC-1 dilepaskan dari mitokondria, konsentrasinya menurun, dan berubah menjadi bentuk monomer yang memancarkan fluoresensi hijau. Oleh karena itu, perubahan warna secara langsung mencerminkan perubahan potensial membran mitokondria. Derajat depolarisasi mitokondria juga dapat diukur dengan rasio intensitas fluoresensi merah/hijau. Deteksi JC-1 adalah metode yang umum.

3. Apoptosis lambat: Metode TUNEL (metode pelabelan fragmen DNA in situ)

Pada tahap akhir apoptosis, sejumlah besar terminal 3-OH yang lengket diproduksi karena putusnya untai ganda atau putusnya untai tunggal DNA kromosom. Di bawah aksi deoxyribonucleotide terminal transferase (TdT), dUTP berlabel luciferase dapat diikat ke terminal 3 DNA, sehingga sel-sel apoptosis dapat dideteksi, metode tersebut disebut terminal deoxynucleotidyltransferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). Karena sel-sel normal atau yang berkembang biak hampir tidak memiliki putusnya DNA, tidak ada pembentukan 3-OH dan sedikit yang dapat diwarnai. TUNEL sebenarnya adalah metode penelitian yang menggabungkan biologi molekuler dan morfologi. Pewarnaan in situ dari inti apoptosis tunggal yang lengkap atau badan apoptosis dapat secara akurat mencerminkan karakteristik biokimia dan morfologi khas apoptosis. Dapat digunakan untuk menentukan morfologi sel pada potongan jaringan yang tertanam dalam parafin, potongan jaringan beku, sel yang dikultur, dan sel yang diisolasi dari jaringan, serta dapat mendeteksi sejumlah kecil sel apoptosis. Oleh karena itu, alat ini banyak digunakan dalam studi apoptosis.

Produk terkait: