Kit deteksi apoptosis sel Annexin V-EGFP/PI menggunakan Annexin V berlabel EGFP sebagai pemeriksaan untuk mendeteksi terjadinya apoptosis sel dini.
Prinsip deteksi adalah sebagai berikut: pada sel hidup normal, fosfotidilserin (PS) terletak di sisi dalam membran sel, tetapi pada sel apoptotik awal, PS berpindah dari sisi dalam membran sel ke permukaan membran sel dan terpapar ke lingkungan ekstraseluler. Annexin-V adalah Ca²⁺ Protein pengikat fosfolipid yang bergantung pada asam amino dengan berat molekul 35 hingga 36 kDa yang mengikat PS dengan afinitas tinggi. Fosfatidil serin dapat mengikat membran sel apoptosis dini melalui fosfatidil serin yang terekspos di bagian luar sel.
Selain itu, Propidium Iodida (PI) diberikan untuk membedakan sel-sel awal yang masih hidup dari sel-sel nekrotik atau sel-sel apoptotik akhir. PI adalah pewarna asam nukleat, yang tidak dapat menembus membran sel utuh dari sel-sel normal atau sel-sel apoptotik awal tetapi dapat menembus membran sel-sel apoptotik akhir dan sel-sel nekrotik dan membuat nukleus berwarna merah. Jadi, ketika Annexin V dikombinasikan dengan PI, PI dikeluarkan dari sel-sel hidup (Annexin V^-/PI^-) dan sel apoptosis awal (Annexin V⁺/PI^-). Sel-sel yang mengalami apoptosis dan nekrotik lanjut memiliki nilai positif ganda untuk EGFP dan PI (Annexin V⁺/PI⁺).
Kit ini cocok untuk flow cytometry dan mikroskop fluoresensi.

Komponen Produk

Pengiriman dan Penyimpanan

Komponen dikirim dengan kemasan es dan dapat disimpan pada suhu -20°C, terhindar dari cahaya, dan hindari pembekuan dan pencairan berulang kali selama 1 tahun.
[Catatan]: Jika perlu digunakan berulang kali dalam waktu singkat, dapat disimpan pada suhu 4℃ dan terlindungi dari cahaya selama setengah tahun.

Perhatian

1) Karena apoptosis merupakan proses yang cepat, sebaiknya sampel dianalisis dalam waktu 1 jam setelah pewarnaan.
2) Untuk sel yang melekat, pencernaan merupakan langkah yang penting. Jangan gunakan EDTA dalam larutan pencernaan karena EDTA dapat memengaruhi pengikatan Annexin V ke PS.
3) Annexin V-FITC, tetapi bukan Annexin V-EGFP, harus digunakan untuk memfiksasi sel, seperti untuk mendeteksi apoptosis dan siklus sel pada saat yang sama, karena EGFP akan terdenaturasi dan kehilangan kemampuannya untuk memicu fluoresensi selama fiksasi. Sel diinkubasi dengan Annexin V-FITC sebelum fiksasi dan Annexin V-FITC yang tidak terikat dicuci dengan Binding Buffer.Karena peningkatan permeabilitas sel selama fiksasi menciptakan serpihan sel yang dapat mengikat Annexin V dan mengganggu hasilnya.
4) Jika sampelnya dari darah, pastikan untuk membuang trombosit dari darah. Karena trombosit mengandung PS, yang dapat mengikat Annexin V, sehingga mengganggu hasil. Trombosit dapat dibersihkan dengan menggunakan agen penyangga yang mengandung EDTA dan disentrifugasi pada kecepatan 200 g.
5) Harap sentrifus reagen sebentar sebelum membuka penutup, dan tuangkan cairan pada dinding bagian dalam penutup ke dasar tabung untuk menghindari percikan cairan saat membuka penutup.
6) Annexin V-EGFP dan PI adalah zat fotosensitif, jadi harap hindari cahaya selama pengoperasian.
7) Hanya untuk keperluan penelitian!

Instruksi

Desain percobaan
Tabung kosong: Sel kontrol negatif tanpa Annexin V-EGFP dan Larutan Pewarnaan PI digunakan untuk pengaturan tegangan.
Tabung pewarnaan tunggal: Sel kontrol positif, yang hanya dilengkapi dengan Annexin V-EGFP, digunakan untuk memodulasi kompensasi.
Tabung pendeteksi: Sel-sel diperlakukan dengan Annexin V-EGFP dan Larutan Pewarnaan PI. Data eksperimen diperoleh dengan menyesuaikan parameter tabung kosong dan tabung pewarna tunggal.
1.1 Pewarnaan sampel
1) sel suspensi: Sel dikumpulkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 300 g selama 5 menit pada suhu 4 °C.
Sel yang melekat: Setelah pencernaan dengan tripsin tanpa EDTA, sel dipanen dengan sentrifugasi pada kecepatan 300 g selama 5 menit pada suhu 4 °C. Waktu pencernaan tripsin tidak boleh terlalu lama untuk mencegah hasil positif palsu.
2) Sel dicuci dengan PBS yang telah didinginkan sebelumnya dua kali, setiap kali pada kecepatan 300 g, dan disentrifugasi pada suhu 4 ℃ selama 5 menit.
3) Sel disuspensikan kembali dengan 1×Binding Buffer dan konsentrasinya disesuaikan menjadi 1~5 ×106/mL.
4) 100 μL suspensi sel ditambahkan ke dalam tabung flow cytometry 5 mL, 5 μl Annexin V-EGFP ditambahkan, dan sel dicampur dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar di bawah cahaya.
5) Menambahkan 10 μl Larutan PI dan 400 μl PBS, Pewarnaan segera dilakukan.
[Catatan]: Saat menggunakan flow cytometry untuk mendeteksi apoptosis, PI sangat dipengaruhi oleh waktu, dan waktu yang terlalu lama akan menyebabkan peningkatan pewarnaan PI, jadi flow cytometry harus diselesaikan dalam waktu 1 jam.
1.2 Analisis aliran sitometri
Panjang gelombang eksitasi maksimum EGFP adalah 488 nm, dan panjang gelombang emisi maksimum adalah 507 nm; Panjang gelombang eksitasi maksimum kompleks PI-DNA adalah 535 nm, dan panjang gelombang emisi maksimum adalah 615 nm. Perangkat lunak seperti CellQuest digunakan untuk analisis dan plot titik dua warna digambar, EGFP adalah absis dan PI adalah ordinat. Kumpulkan 10.000 kejadian per sampel. Dalam percobaan yang umum, sel-sel dapat dibagi menjadi tiga subkelompok, sel-sel hidup hanya memiliki fluoresensi latar belakang intensitas sangat rendah, sel-sel apoptosis awal hanya memiliki fluoresensi hijau yang kuat, dan sel-sel apoptosis akhir memiliki pewarnaan ganda fluoresensi hijau dan merah.