Prinsip deteksi kit deteksi apoptosis Annexin V-Alexa Fluor488/PI adalah sebagai berikut: pada sel hidup normal, fosfotidilserin (PS) terletak di sisi dalam membran sel, tetapi pada sel apoptotik awal, PS berpindah dari sisi dalam membran sel ke permukaan membran sel dan terpapar ke lingkungan ekstraseluler. Annexin-V adalah Ca²⁺ -protein pengikat fosfolipid yang bergantung pada asam amino dengan berat molekul 35 hingga 36KD, yang berikatan dengan afinitas tinggi terhadap PS dan berikatan dengan membran sel sel apoptosis awal melalui fosfatidilserin yang terpapar di luar sel.
Selain itu, Propidium Iodida (PI) diberikan untuk membedakan sel-sel awal yang masih hidup dari sel-sel nekrotik atau sel-sel apoptotik akhir. PI adalah pewarna asam nukleat, yang tidak dapat menembus membran sel utuh dari sel-sel normal atau sel-sel apoptotik awal tetapi dapat menembus membran sel-sel apoptotik akhir dan sel-sel nekrotik dan membuat nukleus berwarna merah. Jadi, ketika Annexin V dikombinasikan dengan PI, PI dikeluarkan dari sel-sel hidup (Annexin V^-/PI^-) dan sel apoptosis awal (Annexin V⁺/PI^-). Sebaliknya, sel-sel apoptotik dan nekrotik lanjut positif ganda untuk Alexa Fluor488 dan PI (Annexin V⁺/PI⁺).

Komponen Produk

Pengiriman dan Penyimpanan

Komponen dikirim dengan kemasan es dan dapat disimpan pada suhu -20°C selama 1 tahun.

Perhatian

1) Karena apoptosis merupakan proses yang cepat, sebaiknya sampel dianalisis dalam waktu 1 jam setelah pewarnaan.
2) Untuk sel yang melekat, pencernaan merupakan langkah yang penting. Jangan gunakan EDTA dalam larutan pencernaan karena EDTA dapat memengaruhi pengikatan Annexin V ke PS.
3) Jika sampelnya dari darah, pastikan untuk membuang trombosit dari darah. Karena trombosit mengandung PS, yang dapat mengikat Annexin V, sehingga mengganggu hasil. Agen penyangga yang mengandung EDTA dapat digunakan dan trombosit dibuang dengan sentrifugasi pada kecepatan 200 g.
4) Harap sentrifus reagen sebentar sebelum membuka penutup, dan tuangkan cairan pada dinding bagian dalam penutup ke dasar tabung untuk menghindari percikan cairan saat membuka penutup.
5) Annexin V-Alexa Fluor488 dan PI adalah zat fotosensitif dan harus dijauhkan dari cahaya saat menanganinya.
6) Hanya untuk keperluan penelitian!

Instruksi

1.1 Contoh pewarnaan
1.a) sel suspensi: Sel dikumpulkan melalui sentrifugasi pada kecepatan 300 g selama 5 menit pada suhu 4°C.
b) sel yang melekat: Setelah pencernaan dengan tripsin tanpa EDTA, sel dipanen dengan sentrifugasi pada 300 g selama 5 menit pada suhu 4 °C. Waktu pencernaan tripsin tidak boleh terlalu lama untuk mencegah hasil positif palsu.
2. Sel dicuci dua kali dengan PBS yang didinginkan terlebih dahulu pada suhu 4 °C, setiap kali menggunakan 300g, dan disentrifugasi pada suhu 4 °C selama 5 menit.
3. Sel disuspensikan kembali dengan menambahkan 250 μL 1×Binding Buffer, dan konsentrasinya disesuaikan menjadi 1×106/mL.
4. 100 μL suspensi sel ditambahkan ke dalam tabung flow cytometry 5mL, 5μL Annexin V-Alexa Fluor 488 dan 10 μL PI ditambahkan, dan dicampur perlahan.
5. Reaksi dijauhkan dari cahaya dan disimpan pada suhu ruangan selama 15 menit.
6. 400 μL 1×Binding Buffer ditambahkan, dicampur, dan sampel dideteksi dengan flow cytometry dalam waktu 1 jam.
[Catatan]: Untuk menghindari hilangnya sel selama pencucian sel, Tip kecil dapat digunakan untuk menyedot cairan.
1.2 Analisis aliran sitometri
Alexa Fluor488 memiliki panjang gelombang eksitasi maksimum 488 nm dan panjang gelombang emisi maksimum 519 nm; Panjang gelombang eksitasi maksimum kompleks PI-DNA adalah 535 nm, dan panjang gelombang emisi maksimum adalah 615 nm. CellQuest dan perangkat lunak lainnya digunakan untuk menganalisis dan menggambar plot titik dua warna dengan Alexa Fluor488 sebagai absis dan PI sebagai ordinat. Kumpulkan 10.000 kejadian per sampel.
1.3 Analisis mikroskop fluoresensi
1) Teteskan setetes suspensi sel yang diwarnai ganda dengan Annexin V-FITC/PI ke atas slide dan tutupi sel dengan penutup kaca.
2) Diamati di bawah mikroskop fluoresensi dengan filter dua warna. Sinyal fluoresensi Annexin V-FITC berwarna hijau, dan sinyal fluoresensi PI berwarna merah.