Ketika sel mengalami apoptosis, mereka mengaktifkan enzim endonuklease yang memotong DNA genom di antara nukleosom. Setelah DNA diekstraksi selama apoptosis, tangga DNA sepanjang 180-200 bp dapat ditemukan.
Kit deteksi apoptosis TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) (Alexa Fluor 640) dapat digunakan untuk mendeteksi fragmentasi DNA nuklir dalam proses apoptotik akhir sel jaringan. Prinsipnya adalah bahwa di bawah aksi Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT), Alexa Fluor 640-12-DUTP dimasukkan ke dalam Terminal 3´-hidroksil (3´-OH) yang terpapar selama pemutusan DNA genomik. Dengan demikian, zat ini dapat dideteksi dengan mikroskop fluoresensi atau flow cytometry. Alexa Fluor 640 adalah pewarna fluoresensi merah dengan stabilitas tinggi dan kecerahan yang kuat.
Kit ini memiliki berbagai macam aplikasi dan dapat digunakan untuk mendeteksi apoptosis pada irisan beku atau parafin, serta pada sel-sel yang melekat atau tersuspensi dalam kultur.

Komponen Produk

Pengiriman dan Penyimpanan

Komponen dikirim dengan kemasan es dan dapat disimpan pada suhu -20°C selama 1 tahun.

Perhatian

1. Perlu menyiapkan PBS sendiri untuk mencuci sel, larutan antifluoresensi untuk menyegel tablet, dan paraformaldehida 4% untuk fiksasi. Leukosit mungkin perlu dikultur dalam waktu lama.
2. Hanya untuk keperluan penelitian!

Instruksi

1. Persiapan sampel
1.1 Potongan jaringan yang tertanam dalam parafin
1.1.1. Potongan jaringan parafin direndam dalam xilena selama 5 menit pada suhu ruangan dan diulang sekali lagi untuk menghilangkan parafin secara menyeluruh.
1.1.2.Rendam bagian tersebut dalam etanol 100% selama 5 menit pada suhu ruangan dan ulangi sekali.
1.1.3.Pada suhu ruangan, sampel direndam dengan etanol gradien (90, 80, 70%) selama 3 menit setiap kali.
1.1.4. Bilas potongan-potongan tersebut dengan lembut menggunakan PBS dan seka dengan hati-hati cairan berlebih di sekitar sampel pada slide kaca dengan kertas saring. Dalam hal ini, pena parafin atau pena hidrofobik dapat digunakan untuk menggambar garis besar distribusi sampel di sekitar sampel, yang praktis untuk pemrosesan permeabilitas hilir dan operasi pelabelan keseimbangan. Jangan biarkan sampel mengering selama percobaan. Masukkan sampel yang telah diproses ke dalam kotak basah agar sampel tetap basah.
1.1.5.2 mg/mL Larutan Proteinase K diencerkan dengan PBS dengan perbandingan 1:100 untuk mencapai konsentrasi akhir 20 μg/mL.
1.1.6.100 μL larutan Proteinase K pada konsentrasi 20 μg/mL ditambahkan ke setiap sampel hingga menutupinya sepenuhnya dan diinkubasi pada suhu kamar selama 20 menit.
[Catatan]: Proteinase K membantu jaringan dan sel menjadi permeabel terhadap reagen pewarnaan pada langkah berikutnya. Waktu inkubasi yang terlalu lama akan meningkatkan risiko bagian jaringan terlepas dari pelat pembawa pada langkah pencucian berikutnya, sedangkan waktu inkubasi yang terlalu pendek dapat menyebabkan perlakuan permeabilitas yang tidak memadai dan memengaruhi efisiensi pelabelan. Untuk memperoleh hasil yang lebih baik, mungkin perlu mengoptimalkan waktu inkubasi Proteinase K.
1.1.7. Bilas sampel 2-3 kali dengan larutan PBS, buang cairan berlebih dengan hati-hati, dan serap cairan di sekitar sampel pada slide dengan kertas saring. Sampel yang telah diproses ditempatkan dalam kotak basah agar sampel tetap lembap.
1.2 Potongan jaringan beku
1.2.1. Angkat potongan beku dan kembalikan ke suhu ruangan. Kaca objek direndam dalam larutan paraformaldehida 4% (dilarutkan dalam PBS) dan difiksasi serta diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan.
1.2.2. Buang kelebihan cairan secara perlahan dan gunakan kertas saring untuk mengeringkan kelebihan cairan di sekitar sampel pada slide kaca.
1.2.3. Kaca objek direndam dalam larutan PBS, diinkubasi pada suhu ruangan selama 15 menit, dan dicuci lagi dengan PBS sebanyak 2 kali.
1.2.4. Buang cairan berlebih dengan hati-hati dan seka slide kaca dengan hati-hati menggunakan kertas saring untuk membuang cairan berlebih di sekitar sampel. Dalam hal ini, pena parafin atau pena hidrofobik dapat digunakan untuk menggambar garis besar distribusi sampel di sekitar sampel, yang praktis untuk pemrosesan permeabilitas hilir dan operasi pelabelan keseimbangan. Selama percobaan, jangan biarkan sampel mengering, dan masukkan sampel yang telah diproses ke dalam kotak basah agar sampel tetap basah.
1.2.5. Larutan Proteinase K 2 mg/mL diencerkan dengan PBS dengan perbandingan 1:100 untuk mencapai konsentrasi akhir 20 μg/mL.
1.2.6. 100 μL larutan Proteinase K pada konsentrasi 20 μg/mL ditambahkan ke setiap sampel hingga menutupinya sepenuhnya dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit.
[Catatan]: Proteinase K membantu jaringan dan sel agar dapat ditembus reagen pewarna pada langkah berikutnya. Waktu inkubasi yang terlalu lama akan meningkatkan risiko bagian jaringan terlepas dari pelat pembawa pada langkah pencucian berikutnya, sedangkan waktu inkubasi yang terlalu pendek dapat menyebabkan perlakuan permeabilitas yang tidak memadai dan memengaruhi efisiensi pelabelan. Mungkin perlu untuk mengoptimalkan waktu inkubasi Proteinase K jika hasil yang lebih baik tidak diperoleh.
1.2.7. Bilas sampel 2-3 kali dalam gelas kimia terbuka yang berisi larutan PBS.
[Catatan]: Untuk menghindari hilangnya pengelupasan sampel pada langkah pembersihan, disarankan untuk tidak mencuci botol, tetapi merendam slide kaca dalam larutan PBS 2-3 kali untuk dibersihkan.
1.2.8. Buang cairan berlebih secara perlahan dan gunakan kertas saring untuk mengeringkan cairan di sekitar sampel pada slide.Sampel yang telah diolah ditempatkan dalam kotak basah untuk menjaga kelembapan sampel.
1.3 Persiapan lembar perayapan sel
Sel-sel yang melekat dikulturkan pada Kaca Laboratorium Lab-Tek. Setelah pengobatan induksi apoptosis, kaca dicuci dua kali dengan PBS.
1.4 Persiapan apusan sel (Mengambil contoh slide yang dilapisi poli-lisin)
1.4.1. Sel-sel disuspensikan kembali dalam PBS pada konsentrasi sekitar 2×107 sel/mL, 50-100 μL suspensi sel disedot ke slide yang dilapisi poli-lisin, dan suspensi sel disebarkan perlahan-lahan dengan slide yang bersih.
1.4.2. Sel-sel difiksasi, dan slide direndam dalam tangki pewarnaan yang berisi 4% paraformaldehida yang baru disiapkan dalam PBS dan ditempatkan pada suhu 4 ° C selama 25 menit.
1.4.3. Kaca objek dicuci, direndam dalam PBS, dan dibiarkan pada suhu ruangan selama 5 menit. Cuci lagi dengan PBS.
1.4.4. Buang cairan berlebih dengan hati-hati dan seka slide kaca dengan hati-hati menggunakan kertas saring untuk membuang cairan berlebih di sekitar sampel. Dalam kasus ini, pena parafin atau pena hidrofobik dapat digunakan untuk menguraikan distribusi sampel di sekitar sampel guna memfasilitasi pemrosesan permeabilitas hilir dan operasi pelabelan keseimbangan. Selama percobaan, jangan biarkan sampel mengering, dan masukkan sampel yang telah diproses ke dalam kotak basah agar sampel tetap basah.
1.4.5. Larutan Proteinase K 2 mg/mL diencerkan dengan PBS pada rasio 1:100 untuk mencapai konsentrasi akhir 20 μg/mL.
1.4.6. 100 μL larutan Proteinase K pada konsentrasi 20 μg/mL ditambahkan ke setiap sampel hingga tertutup seluruhnya dan diinkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit (dapat juga direndam dalam larutan Triton X-100 0,2% yang disiapkan dalam PBS dan diinkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit untuk perlakuan permeabilitas).
[Catatan]: Proteinase K membantu jaringan dan sel agar dapat ditembus reagen pewarna pada langkah berikutnya. Waktu inkubasi yang terlalu lama akan meningkatkan risiko bagian jaringan terlepas dari pelat pembawa pada langkah pencucian berikutnya, sedangkan waktu inkubasi yang terlalu pendek dapat menyebabkan perlakuan permeabilitas yang tidak memadai dan memengaruhi efisiensi pelabelan. Mungkin perlu untuk mengoptimalkan waktu inkubasi Proteinase K jika hasil yang lebih baik tidak diperoleh.
1.4.7. Bilas sampel 2-3 kali dengan PBS, buang cairan berlebih dengan hati-hati, dan serap cairan di sekitar sampel pada slide dengan kertas saring. Sampel yang telah diproses ditempatkan dalam kotak basah.
2. Langkah-langkah pengobatan DNase pada kontrol positif
Setelah permeasi sampel, sel diperlakukan dengan DNase I untuk menyiapkan slide kontrol positif. Proses ini biasanya menyebabkan sebagian besar sel diolah hingga menunjukkan fluoresensi hijau.
[Catatan]: Perlakuan Dnase I pada sel yang diimobilisasi menyebabkan kerusakan DNA kromosom, menghasilkan banyak ujung 3' DNA yang dapat diberi label.
2.1. Encerkan 10×DNase I Buffer dengan air deionisasi pada rasio 1:10 (200 µL 1× DNase I Buffer diperlukan untuk setiap sampel, yaitu, 20 µL 10× DNase I Buffer dan 180 µL air deionisasi diperlukan untuk pengenceran). Setetes 100 µl ditambahkan ke sampel yang dapat ditembus dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruangan. Tambahkan 1 μL DNase I (1U/μL) ke sisa 100 μL 1×DNase I Buffer untuk mencapai konsentrasi akhir 10 U/mL.
2.2. Cairan diketuk perlahan, lalu 100 μL buffer berisi 10 U/mL DNase I ditambahkan dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan.
2.3. Ketuk slide untuk membuang cairan yang berlebih, dan cuci slide secara menyeluruh 3-4 kali dalam tangki pewarna dengan air deionisasi.
[Catatan]: Tangki pewarnaan terpisah harus digunakan untuk slide kontrol positif, jika tidak, DNase I yang tersisa pada slide kontrol positif dapat menimbulkan latar belakang yang tinggi pada slide eksperimen.
3. Pelabelan dan Deteksi
3.1.Buffer Ekuilibrasi (5 x Buffer Ekuilibrasi) diencerkan dengan air deionisasi dalam rasio 1:5 (100 μL 1 x Buffer Ekuilibrasi diperlukan untuk setiap sampel).
3.2. Buffer Ekuilibrasi (100 μL 1× Buffer Ekuilibrasi) ditambahkan ke setiap sampel untuk menyeimbangkan area secara menyeluruh dan diinkubasi selama 10-30 menit pada suhu kamar. Atau, masukkan ke dalam tong dengan 1 x Buffer Ekuilibrasi untuk memastikan bahwa slide tidak menyeimbangkan sampel. Cairkan Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix di atas es sambil menyeimbangkan sel, dan siapkan buffer inkubasi TdT yang cukup untuk semua percobaan dan reaksi kontrol positif opsional sesuai dengan Tabel 1. Untuk reaksi standar dengan area kurang dari 5 cm2, volumenya adalah 50 μl, dan 50 μL dikalikan dengan jumlah reaksi eksperimen dan kontrol positif untuk menentukan volume total buffer inkubasi TdT yang diperlukan. Untuk sampel dengan luas permukaan yang lebih besar, volume reagen dapat ditingkatkan secara proporsional.

Tabel 1. Buffer inkubasi TdT yang disiapkan untuk percobaan dan reaksi kontrol positif opsional

[Sistem kontrol negatif]: Buffer inkubasi kontrol tanpa enzim TdT disiapkan dan enzim TdT diganti dengan ddH2O.
3.3. Sebagian besar 100 μL 1×Equilibration Buffer dicuci dengan kertas penyerap di sekitar area yang diseimbangkan dan kemudian 50 μLTdT incubation Buffer ditambahkan ke area sel seluas 5 cm2. Jangan biarkan sel mengering. Setelah ini, slide harus dilindungi dari cahaya.
3.4. Tutupi sel dengan penutup plastik untuk memastikan reagen terdistribusi secara merata, dan letakkan handuk kertas yang dibasahi air di bagian bawah kotak basah. Kaca objek ditempatkan dalam kotak basah dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 60 menit. Bungkus kotak basah dengan aluminium foil untuk melindunginya dari cahaya.
[Catatan]: Kaca penutup plastik dapat dipotong menjadi dua sebelum digunakan. Lipat tepi kaca penutup agar mudah dilepas dan digunakan.
3.5. Penutup plastik dilepas, dan potongan diinkubasi dalam larutan PBS pada suhu ruangan selama 5 menit. Kemudian potongan dicuci dua kali dengan PBS baru.
3.6. Usap perlahan larutan PBS di sekeliling dan bagian belakang sampel dengan kertas saring.
[Catatan]: Untuk mengurangi latar belakang, setelah mencuci slide dengan PBS satu kali, slide dapat dicuci dengan PBS yang mengandung 0,1% Triton X-100 dan 5 mg/mL BSA sebanyak 3 kali, masing-masing 5 menit, sehingga penanda bebas yang tidak bereaksi dapat menjadi bening dan bersih.
3.7. Sampel diwarnai dalam tangki pewarnaan, dan slide direndam dalam tangki pewarnaan yang berisi larutan PI (1 μg/mL, baru disiapkan dan diencerkan dengan PBS) dalam gelap dan dibiarkan pada suhu ruangan selama 5 menit. (Opsional) : Sampel diwarnai dalam tangki pewarnaan, dan slide direndam dalam tangki pewarnaan yang berisi larutan DAPI (2 μg/mL, baru disiapkan dan diencerkan dengan PBS) dalam gelap, dan dibiarkan pada suhu ruangan selama 5 menit.
3.8.Cuci sampel, rendam slide dalam air deionisasi dan biarkan pada suhu ruangan selama 5 menit. Ulangi dua kali untuk total tiga kali pencucian.
3.9. Kelebihan air pada slide dikeringkan dan 100 μl PBS ditambahkan ke area sampel untuk menjaga kelembaban sampel.
3.10. Sampel segera dianalisis di bawah mikroskop fluoresensi, fluoresensi merah Alexa Fluor 640 terdeteksi pada 620 nm dan DAPI biru diamati pada 460 nm. DAPI dapat mewarnai sel apoptotik dan non-apoptotik menjadi biru, dan hanya pada inti apoptotik Alexa Fluor 640-12-dUTP dimasukkan dan fluoresensi merah terlokalisasi. Jika perlu, slide dapat disimpan semalam pada suhu 4 ° C dalam gelap.
4. Sel suspensi dideteksi dengan flow cytometry
4.1. 3~5×106 sel dicuci dua kali dengan PBS melalui sentrifugasi (300×g) pada suhu 4 °C, disentrifugasi pada 300 g pada suhu 4 °C selama 10 menit, dan kemudian disuspensikan kembali dalam 0,5 mL PBS.
4.2. Sel-sel difiksasi, dan 5 mL larutan paraformaldehida 1% yang disiapkan dalam PBS ditambahkan dan ditempatkan di atas es selama 20 menit.
4.3. Sel disentrifugasi pada 300 × g pada suhu 4 ° C selama 10 menit, dan supernatan dibuang dan disuspensikan kembali dalam 5 mL PBS. Pencucian diulang sekali dan sel disuspensikan kembali dengan 0,5 mL PBS.
4.4. Sel-sel tersebut ditembus, dan 5 mL etanol 70% yang didinginkan terlebih dahulu dengan es ditambahkan dan diinkubasi pada suhu -20 °C selama 4 jam. Sel-sel tersebut dapat disimpan dalam etanol 70% pada suhu -20℃ selama seminggu, atau sel-sel tersebut dapat ditembus dengan larutan Triton X-100 0,2% yang disiapkan dalam PBS dan disimpan pada suhu ruangan selama 5 menit.
4.5. Sel disentrifugasi pada 300 × g selama 10 menit dan disuspensikan kembali dalam 5 mL PBS. Sentrifugasi diulang dan disuspensikan kembali dalam 1 mL PBS.
4.6. Pindahkan 2 × 106 sel ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 ml.
4.7. Ekuilibrasi disentrifugasi pada 300 × g selama 10 menit, dan supernatan dikeluarkan dan disuspensikan kembali dengan 80 μL 1 × Equilibration Buffer. Inkubasi pada suhu kamar selama 5 menit.
4.8. Saat menyeimbangkan sel, Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix dicairkan di atas es, dan jumlah buffer inkubasi TdT yang cukup untuk semua reaksi disiapkan sesuai dengan Tabel 1. Untuk reaksi standar 2 × 106 sel, volumenya adalah 50 μL, dan 50 μL dikalikan dengan jumlah reaksi untuk menentukan total volume buffer inkubasi TdT yang dibutuhkan.
4.9. Sel disentrifugasi pada 300 × g selama 10 menit, supernatan dibuang dan endapan disuspensikan kembali dalam 50 μL buffer inkubasi TdT dan diinkubasi pada 37℃ selama 60 menit, terlindung dari cahaya. Sel disuspensikan kembali dengan hati-hati setiap 15 menit dengan mikropipet.
4.10. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 1 mL EDTA 20 mM dan mencampurnya perlahan-lahan dengan mikropipet.
4.11. Setelah disentrifugasi pada kecepatan 300g selama 10 menit, supernatan dibuang dan endapan disuspensikan kembali dalam 1 mL larutan Triton X-100 0,1% yang dibuat dalam PBS, yang mengandung 5 mg/mL BSA. Larutan diulang sekali dan dicuci dua kali secara total.
4.12. Sel dianalisis dengan flow cytometry dan fluoresensi merah Alexa Fluor 640 pada 620 nm diukur.