1.Latar Belakang Laminin 521
Laminin 521 (LN521) adalah protein adhesi sel utama dalam ceruk sel induk alami dan matriks untuk kultur dan perluasan sel induk embrionik manusia (hES) dan sel induk pluripoten terinduksi (hiPSC). LN521 mengikat reseptor permukaan sel dan mengaktifkan jalur pensinyalan sel, sehingga menghasilkan produksi sel yang lebih fungsional.
Laminin 521 mereproduksi lingkungan hPSC yang relevan secara biologis secara in vitro, meningkatkan perlekatan, kelangsungan hidup yang tinggi, dan pembaruan diri jangka panjang yang kuat dari hPSC, dan merupakan protein matriks utama yang mendukung pertumbuhan sel punca dan menjaga stabilitas struktur dan kinerja membran dasar. Laminin 521 juga merupakan salah satu matriks kultur bebas nutrisi yang paling umum digunakan. Selain itu, Laminin 521 dapat mencapai pengoperan sel tunggal yang efisien dari sel punca yang stabil secara genetik dan pluripoten tanpa penambahan penghambat apoptosis apa pun. Sel-sel tumbuh dalam satu lapisan tunggal yang seragam tanpa perlu membuang area diferensiasi secara manual. Selain itu, penelitian telah menunjukkan bahwa LN521 dapat mendukung pertumbuhan PSC selama lebih dari 10 generasi tanpa tanda-tanda kelainan kariotipe, dan mempertahankan kemampuan PSC untuk berdiferensiasi menjadi tiga lapisan germinal, yaitu lapisan germinal dalam, tengah, dan luar.
Gambar 1. Struktur Laminin 521 [1]
2. Percobaan pelapisan laminin
2.1 Siapkan laminin 521 hingga 400µg/ml dengan air deionisasi steril atau air untuk injeksi. Sebaiknya encerkan lebih lanjut hingga 100µg/ml dengan 1×DPBS steril (Ca++/Mg++) sebelum digunakan, lalu encerkan hingga mencapai konsentrasi kerja 5-10µg/ml dengan DPBS steril (Ca++/Mg++). Konsentrasi pelapis bervariasi tergantung pada jenis sel yang dikultur, dan sebaiknya protokol eksperimen dioptimalkan untuk menentukan konsentrasi pelapis optimal bagi sel. Lihat Tabel 1 untuk konsentrasi yang disarankan.
Catatan: DPBS mengandung Ca2+ dan Mg2+ harus digunakan, karena kation divalen penting untuk struktur dan fungsi protein. Konsentrasi kerja Laminin 521 yang dibutuhkan bergantung pada sel dan aplikasinya. Kami merekomendasikan konsentrasi pelapisan awal sebesar 0,5μg/cm2.
Tabel 1. Volume larutan kerja laminin manusia rekombinan yang direkomendasikan untuk berbagai wadah kultur.
| Cawan Petri | Konsentrasi pelapisan (μg/mL) | Jumlah tambahan LN521 | Jumlah tambahan 1*DPBS | Jumlah volume |
| 6 sumur | 5 | 50 μL/sumur | 950 μL/sumur | 1 mL/sumur |
| 12 sumur | 5 | 25 μL/sumur | 475 μL/sumur | 0,5 mL/sumur |
| 24 sumur | 5 | 15 μL/sumur | 285 μL/sumur | 0,3 mL/sumur |
| 48 sumur | 5 | 7,5 μL/sumur | 142,5 μL/sumur | 150 μL/sumur |
| 96 sumur | 5 | 3,5 μL/sumur | 66.5 μL/sumur | 70 μL/sumur |
| Cawan Petri 35mm | 5 | 50 μL/sumur | 950 μL/sumur | 1 mL/sumur |
| Cawan Petri 60mm | 5 | 100 μL/sumur | 1900 μL/sumur | 2 mL/sumur |
| Cawan Petri 100mm | 5 | 300 μL/sumur | 5700 μL/sumur | 6 mL/sumur |
Volume di atas berdasarkan konsentrasi pelapisan 5μg/mL.
2.2 Tambahkan volume campuran laminin-DPBS yang ditentukan ke setiap sumur dan kocok perlahan. Pastikan seluruh permukaan tertutup dengan larutan pelapis laminin, karena permukaan yang tidak dilapisi tidak mendukung pertumbuhan sel.
2.3. Letakkan pelat dalam inkubator 37°C dan inkubasi semalaman. Waktu inkubasi minimum adalah 2 jam, tetapi inkubasi semalaman direkomendasikan untuk memperoleh kondisi kultur sel yang ideal. Berhati-hatilah agar wadah kultur tidak mengering, yang akan menonaktifkan LN521.
2.4. Saat sel siap untuk disemai, aspirasikan larutan laminin 521.
3. Budaya iPSC
3.1 Pencairan iPSC (mengambil pelat 12 sumur sebagai contoh)
3.1.1 Keluarkan iPSC dari nitrogen cair atau es kering dan cairkan dalam air 37°C selama 10 detik.
3.1.2 Sterilkan kriovial dengan alkohol 75% dan pindahkan ke permukaan kerja.
3.1.3 Pindahkan sel ke tabung sentrifus 15 mL baru yang berisi 9 mL DMEM‑F12.
3.1.4 Sentrifus tabung sentrifus 15 mL pada kecepatan 300g selama 5 menit pada suhu ruangan.
3.1.5 Buang larutan laminin dari pelat 12 sumur yang dilapisi.
3.1.6 Buang cairan sel supernatan dan suspensikan kembali iPSC secara perlahan dalam 1 mL mTeSR-plus (mengandung 10 µM Y-27632) dan pindahkan ke pelat 12-sumur yang telah dilapisi. Kocok pelat untuk mendistribusikan sel secara merata hingga kepadatan sel akhir 1×10^5 sel/sumur dan diamkan pada suhu ruangan selama 10 menit. Pastikan kultur tersebut disalurkan dalam waktu 4-5 hari.
3.1.7 Kembalikan pelat 12 sumur ke inkubator 37°C untuk inkubasi.
3.1.8 Media kultur yang mengandung inhibitor ROCK harus dikeluarkan setelah 12-16 jam dan terus dikultur dalam media tanpa inhibitor.
Tabel 2. Kepadatan penyemaian sel dalam wadah kultur yang berbeda, jumlah sel ditentukan berdasarkan laju pertumbuhan sel
| Wadah kultur sel | 6 sumur | 12 sumur | 24 sumur | 96 sumur |
| Nomor sel | 2,5~3,5×105 | Ukuran 6~8×104 | Ukuran 3~4×104 | 0,5~1×104 |
3.2. Protokol Passage iPSC
3.2.1 Buang supernatan kultur dan bilas dengan 1 mL PBS (Ca———/mg/hari———).
Catatan: Gunakan PBS tanpa Ca2+ dan Mg2+, karena kation divalen memiliki efek negatif pada beberapa enzim disosiasi.
3.2.2 Buang PBS dan tambahkan 0,5 mL Gentle Cell Dissociation Reagen.Inkubasi pada suhu ruangan selama 6-8 menit atau amati di bawah mikroskop sampai sel tidak lagi terikat pada pelat.
3.2.3 Tambahkan DMEM-F12 dengan volume yang sama, aduk sel perlahan, pindahkan ke tabung sentrifus pada suhu ruangan, dan sentrifus pada kecepatan 300g selama 5 menit.
3.2.4 Sebelum melewatkan sel, siapkan pelat 12 sumur berlapis laminin.
3.2.5 Buang supernatan dan suspensikan kembali sel dalam media mTeSR‑plus yang mengandung 10 µM Nomor seri Y‑27632.
3.2.6 Pindahkan sel ke dalam pelat 12-sumur berlapis laminin yang telah disiapkan. Kocok pelat dengan perlahan untuk mendistribusikan sel secara merata dan biarkan pada suhu ruangan selama 10 hingga 20 menit.
3.2.7 Tempatkan pelat 12 sumur dalam inkubator 37°C dan inkubasi.
Catatan: iPSC akan cepat berdiferensiasi dan mati setelah tumbuh menjadi satu lapis sel. Untuk mempertahankan pertumbuhan dan pluripotensi, sel-sel ini perlu disalurkan sebelum berkonfluensi.
3.3. Kriopreservasi iPSC
3.3.1 Siapkan reagen disosiasi sel yang lembut.
3.3.2 Lakukan pemisahan sel sesuai dengan protokol passaging iPSC, gunakan jumlah organel sel untuk memastikan kepadatan sel sebelum kriopreservasi.
3.3.3 Setiap tabung sel harus dibekukan pada kepadatan sel 1-2×10^6. Ikuti langkah-langkah sentrifugasi dan penghilangan media kultur sel dalam protokol passaging iPSC. Suspensikan kembali pelet iPSC yang diisolasi dalam volume larutan kriopreservasi yang sesuai.
3.3.4 Tambahkan 1 mL pelet kriopreservasi sel yang disuspensikan kembali ke dalam tabung kriopreservasi 1,5 mL, lakukan program pendinginan, lalu pindahkan ke nitrogen cair untuk penyimpanan jangka panjang.
4. Catatan Penting tentang Pelapis Laminin
4.1. Semua langkah dalam protokol eksperimen harus dilakukan dalam kondisi steril.
4.2. Hindari paparan laminin pada suhu ruangan dalam jangka waktu lama.
4.3. Hindari pembekuan dan pencairan berulang kali
4.4. Setelah dicairkan, larutan stok protein yang belum diencerkan dapat disimpan pada suhu 2~8℃ dalam kondisi steril dan dapat disimpan secara stabil setidaknya selama 3 bulan.
5.Informasi produk terkait
| Nama Produk | Kucing# | Ukuran |
| 92602ES | 10μg/100μg/500μg/1mg |
6.Referensi
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. Analisis kristalografi lengan pendek laminin β2 menunjukkan bagaimana domain LF dimasukkan ke dalam susunan domain LE yang teratur. Matrix Biol. 2017 Jan;57-58:204-212.