Puromisin adalah antibiotik aminoglikosida yang diproduksi oleh Streptomyces alboniger. Obat ini merupakan analog dari ujung 3' molekul aminoasil-tRNA dan dapat mengikat situs A ribosom, bergabung ke dalam rantai peptida yang memanjang, mengganggu translokasi peptida pada ribosom, menyebabkan penghentian rantai prematur selama translasi, dan dengan demikian menghambat sintesis protein.
Gambar 1 Rumus struktur Puromycin (CAS NO. 53-79-2)
Gen pac, yang mengkode puromisin N-asetiltransferase (pac), ditemukan pada bakteri penghasil puromisin Streptomyces alboniger, yang memberikan resistensi terhadap puromisin. Karakteristik ini sekarang digunakan secara luas untuk menyaring galur sel stabil mamalia yang ditransfeksi yang membawa plasmid dengan gen pac. Penggunaan puromisin secara luas dalam penyaringan galur sel stabil terkait dengan karakteristik vektor lentivirus, yang sebagian besar membawa gen pac dalam vektor lentivirus komersial. Dalam kasus tertentu, puromisin juga dapat digunakan untuk menyaring galur E. coli yang ditransformasi dengan plasmid yang membawa gen pac. Puromisin bekerja cepat dan dapat dengan cepat menyebabkan kematian sel pada konsentrasi rendah. Sel mamalia yang melekat sensitif terhadap konsentrasi 2-5 µg/mL puromisin, sementara sel suspensi sudah sensitif terhadap konsentrasi serendah 0,5-2 µg/mL puromisin. Sel mamalia dengan resistensi stabil terhadap puromisin dapat dihasilkan dalam waktu seminggu.
Skrining Garis Sel Stabil
Prinsip Eksperimen
Dengan mengkloning DNA/shRNA eksogen ke dalam vektor yang membawa gen pac, vektor rekombinan ditransfeksi ke dalam sel inang dan diintegrasikan ke dalam kromosomnya, ditransmisikan secara stabil dengan pembelahan sel, dan akhirnya disaring dengan puromisin.
Persiapan dan Pra-eksperimen
1 Konsentrasi Penggunaan yang Direkomendasikan
Sel mamalia: 1-10 μg/mL, konsentrasi optimal perlu ditentukan melalui pra-eksperimen.
E.coli: Untuk penyaringan E. coli stabil yang telah ditransformasi yang membawa gen pac pada media agar LB, gunakan konsentrasi 125 μg/mL. Penyesuaian pH yang tepat diperlukan untuk penyaringan puromisin dari transforman stabil E. coli.
2 Metode Pelarutan
Larutkan puromisin dalam air suling untuk menyiapkan larutan stok 50 mg/mL, saring, sterilkan dengan filter 0,22 μm, alikuot, dan simpan pada suhu -20°C.
3 Penentuan Kurva Pembunuhan Puromycin (menggunakan transfeksi shRNA atau transduksi lentivirus sebagai contoh)
Konsentrasi penyaringan puromisin yang efektif terkait dengan jenis sel, status pertumbuhan, kepadatan sel, metabolisme sel, dan posisi siklus sel. Sangat penting untuk menentukan konsentrasi minimum puromisin yang dapat membunuh sel yang tidak ditransfeksi. Sangat penting untuk melakukan pra-eksperimen penyaringan gradien Puromisin untuk eksperimen pertama guna menetapkan kurva pembunuhan.
- Sel pelat dengan kepadatan 5~8×104sel/sumur dalam pelat 24 sumur dan kultur semalaman.
- Siapkan media penyaringan: Media segar yang mengandung berbagai konsentrasi puromisin (misalnya, 0-15 μg/mL, minimal 5 gradien).
- Ganti dengan media penyaringan yang baru disiapkan, lanjutkan pembiakan, dan amati pertumbuhan sel, ganti media penyaringan baru setiap 2-3 hari.
- Amati kelangsungan hidup sel setiap hari; konsentrasi obat yang secara efektif membunuh semua sel yang tidak ditransfeksi dalam 4-6 hari adalah konsentrasi minimum.
Penyaringan Transfektan Stabil
- Setelah infeksi lentivirus selama 48-72 jam (70-80% konfluensi), kultur sel dalam medium yang mengandung konsentrasi Puromycin yang sesuai selama minimal 48 jam. Ketika semua sel dalam kelompok kontrol yang tidak ditransfeksi dengan puromycin mati, sel-sel yang tersisa dalam kelompok yang terinfeksi virus semuanya adalah sel positif.
【Catatan】: ① Efek antibiotik paling terasa saat sel berada dalam fase pembelahan aktif. Khasiat antibiotik akan berkurang secara signifikan jika sel terlalu padat. Kepadatan sel tidak boleh melebihi 25%. ② Amati status pertumbuhan sel setiap hari; penyaringan puromisin memerlukan setidaknya 48 jam, dan konsentrasi efektif penyaringan puromisin biasanya berlangsung dari 3 hingga 10 hari. Semakin tinggi MOI virus, semakin banyak salinan shRNA dan gen resistensi puromisin yang dikandung setiap sel. Saat melakukan penyaringan puromisin, semakin tinggi MOI, semakin banyak salinan pac yang dikandung sel, dan semakin tinggi konsentrasi puromisin yang dapat ditoleransi. Sesuaikan konsentrasi puromisin untuk menyaring sel yang ditransfeksi, tetapi konsentrasi puromisin tidak boleh lebih rendah dari konsentrasi efektif minimum kurva pembunuhan;
- Tambahkan media kultur yang mengandung konsentrasi minimum Puromycin untuk memperbanyak sel, dan setelah hasil uji qPCR memenuhi syarat, lanjutkan dengan kriopreservasi.
| ProdukS nama | Kucing# | Spesifikasi | Penampilan |
| Puromisin Dihidroklorida Nomor polisi: 58-58-2 | 60210ES25 | 25mg obat kuat | Putih sampai seperti bubuk putih |
| 60210ES60 | 100mg talas | ||
| 60210ES72 | 250mg 250 gram | ||
| 60210ES76 | 500mg talas | ||
| 60210ES80 | 1 G | ||
| Puromisin (Larutan 10 mg/mL) Nomor polisi: 58-58-2 | 60209ES10 | 1×1 ml cairan | Larutan (10 mg/mL dalam H2HAI) |
| 60209ES50 | 5×1ml | ||
| 60209ES60 | 10x1ml | ||
| 60209ES76 | 50x1ml |
Rekomendasi Produk
Publikasi oleh Pelanggan yang Menggunakan Produk Ini (Statistik Parsial: Beberapa)
[1] Zhang D, Liu Y, Zhu Y, dkk. Jalur cGAS-STING-PERK non-kanonik memfasilitasi program translasi yang penting untuk penuaan dan fibrosis organ. Biol Sel Nat . 2022;24(5):766- 782.doi:10.1038/s41556-022-00894-z (JIKA:28.824)
[2] Lu T, Zhang Z, Zhang J, dkk. CD73 dalam vesikel ekstraseluler kecil yang berasal dari HNSCC mendefinisikan imunosupresi terkait tumor yang dimediasi oleh makrofag di lingkungan mikro. Jurnal Vesikel Ekstrasel . 2022;11(5):e12218. doi:10.1002/jev2.12218 (JIKA:25.841)
[3] Meng F, Yu Z, Zhang D, dkk.Pemisahan fase yang diinduksi dari NF2 mutan memenjarakan mesin cGAS-STING untuk menghilangkan kekebalan antitumor. Sel Mol . 2021;81(20):4147-4164.e7.doi: 10.1016/j.molcel.2021.07.040 (JIKA:17.970)
[ 4] Chen S, Liu S, Wang J, dkk. Penargetan DRP1 yang Dimediasi TBK1 Memberikan Penginderaan Asam Nukleat untuk Memprogram Ulang Dinamika dan Fisiologi Mitokondria. Sel Mol . 2020;80(5):810-827.e7.doi:10.1016 /j.molcel.2020.10.018 (JIKA:15.584)
[5] Zhao Q, Zheng K, Ma C, dkk. PTPS Memfasilitasi S-Nitrosilasi LTBP1 yang Terkompartementalisasi dan Meningkatkan Pertumbuhan Tumor dalam Hipoksia. Sel Mol . 2020;77(1 ):95-107.e5. doi:10.1016/j.molcel.2019.09.018 (JIKA:14.548)
[6] Mo J, Liu F, Sun X, dkk. Penghambatan Kompleks FACT Menargetkan Sinyal Landak yang Menyimpang dan Mengatasi Resistensi terhadap Antagonis yang Dihaluskan. Kanker Res . 2021;81(11):3105-3120. doi:10.1158/0008-5472.CAN-20-3186 (JIKA:12.701)
[7] Zou Y, Wang A, Shi M, et al. Analisis lanskap dan dinamika redoks dalam sel hidup dan in vivo menggunakan sensor fluoresensi berkode genetik. Protokol Nasional . 2018;13(10):2362-2386. doi:10.1038/s41596-018-0042-5 (JIKA:12.423)
[8] Mao L, Chen J, Lu X, dkk. Analisis proteomik sel kanker paru-paru mengungkapkan peran penting BCAT1 dalam metastasis sel kanker. Teranostik. 2021;11(19):9705-9720. Diterbitkan 2021 September 27. doi:10.7150/thno.61731 (JIKA:11.556)
[9] Han L, Zhang F, Liu Y, dkk. Protein terkait globulin uterus 1 (UGRP1) mengikat podoplanin (PDPN) untuk mendorong jalur peradangan baru selama infeksi Streptococcus pneumoniae. Clin Transl Med. 2022;12(6):e850. doi:10.1002/ctm2.850 (JIKA:11.492 )
[10] Zhang M, Liu F, Zhou P, dkk. Jalur pensinyalan MTOR mengatur diferensiasi makrofag dari progenitor myeloid tikus dengan menghambat autofagi. Autofagi Bahasa Indonesia: . 2019;15(7):1150-1162. doi:10.1080/15548627.2019. 1578040 (JIKA:11.059)
[11] Zhang S, Yang Z, Bao W, dkk. SNX10 (sorting nexin 10) menghambat inisiasi dan perkembangan kanker kolorektal dengan mengendalikan degradasi autofagik SRC. Autofagi Bahasa Indonesia: . 2020;16(4):735 -749. doi:10.1080/15548627.2019.1632122 (JIKA:11.059)
[12] Zhang Y, Ding H, Wang X, dkk. MK2 meningkatkan degradasi Tfcp2l1 melalui ligase ubiquitin β-TrCP untuk mengatur pembaruan diri sel induk embrionik tikus. Perwakilan Sel . 2021;37(5):109949. doi:10.1016/j.celrep.2021.109949 (JIKA:9.423)
[13] Jiang Y, Dong Y, Luo Y, dkk. Fosforilasi yang dimediasi AMPK pada 53BP1 mempromosikan c-NHEJ. Perwakilan Sel . 2021;34(7):108713. doi:10.1016/j.celrep.2021.108713 (JIKA:9.423)
[14] Sun Q, Ye Y, Gui A, dkk. MORTALIN-Ca 2+ sumbu menggerakkan resistensi rituximab bawaan pada limfoma sel B besar yang difus. Kanker Lett . 2022;537:215678. doi:10.1016/j.canlet.2022.215678 (JIKA:8.679)
[15] Jin R, Zhao A, Han S, dkk. Interaksi S100A16 dan GRP78 mengaktifkan stres retikulum endoplasma yang dimediasi melalui jalur IRE1α/XBP1 pada fibrosis tubulointerstitial ginjal. Penyakit Kematian Sel . 2021;12(10):942. Diterbitkan 13 Oktober 2021. doi: 10.1038/s41419-021-04249-8 (JIKA:8.469)
[16] Zhang P, Zhang Z, Fu Y, dkk.Ubikuitinasi DYRK1A terkait K63 diringankan oleh degradasi EGFR yang dimediasi TRAF2 Sprouty 2. Penyakit Kematian Sel . 2021;12(6):608. Diterbitkan 11 Juni 2021. doi:10.1038/s41419-021-03887-2 (JIKA:8.469)
[17] Zhao T, Li Y, Shen K, Wang Q, Zhang J. Knockdown OLR1 melemahkan metabolisme glikolisis untuk menekan proliferasi sel kanker usus besar dan resistensi kemoterapi dengan menurunkan regulasi SULT2B1 melalui c-MYC. Kematian Sel Dis. 2021;13(1):4. Diterbitkan 17 Desember 2021. doi: 10.1038/s41419-021-04174-w (JIKA:8.469)
[18] Zhou R, Wu Q, Wang M, dkk. Protein fosfatase PPM1A mendefosforilasi dan mengaktifkan YAP untuk mengatur regenerasi usus dan hati mamalia. Jurnal Bioteknologi PLoS . 2021; 19(2):e3001122. Diterbitkan 25 Februari 2021. doi:10.1371/journal.pbio.3001122 (JIKA:8.029)
[19] Wu S, Wang S, Lin X, Yang S, Ba X, Xiong D, Xiao L, Li R. Lanatoside C menghambat replikasi virus herpes simpleks 1 dengan mengatur distribusi NRF2 dalam sel. Fitomedisinfektan. Februari 2024;124:155308. doi: 10.1016/j.phymed.2023.155308. (JIKA:7.9)
[20] Shen K, Song W, Wang H, Wang L, Yang Y, Hu Q, Ren M, Gao Z, Wang Q, Zheng S, Zhu M, Yang Y, Zhang Y, Wei C, Gu J. Menguraikan potensi metastasis dan terapi adjuvan pasca operasi melanoma yang optimal berdasarkan skor metastasis. Penemuan Kematian Sel. 25 Oktober 2023;9(1):397. doi: Nomor telepon: 10.1038/s41420-023-01678-6. (JIKA:Nomor telepon 7.angka 0)
Produk Terkait
| Nama Produk | Kucing# | Spesifikasi |
| Siprofloksasin hidroklorida | 60201ES05/25/60 | 5/25/100 gram |
| Ampisilin, Garam Natrium | 60203ES10/60 | 10/100 gram |
| Doksisiklin hidlat | 60204ES03/08/25 | 1/5/25 gram |
| Kloramfenikol, Kelas USP | 60205ES08/25/60 | 5/25/100 gram |
| Kanamisin Sulfat | 60206ES10/60 | 10/100 gram |
| Tetrasiklin HCl Tetrasiklin hidroklorida (USP) | Nomor telepon 60212ES25/60 | 25/100 gram |
| Vankomisin Hidroklorida | 60213ES60/80/90 | 100mg/1 gram/5 gram |
| Garam Sulfat Gentamycin | 60214ES03/08/25 | 1/5/25 gram |
| Spektinomisin Hidroklorida | 60215ES08 | 5 gram |
| Fleomisin (20 mg/mL dalam larutan) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Blastisidin S (Blastisidin) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nistatin | 60219ES08 | 5 gram |
| G418 Sulfat (Geneticin) | Nomor telepon 60220ES03/08 | 1/5 gram |
| Puromisin (larutan 10 mg/mL) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1/5×1/10×1/50×1 ml |
| Puromisin Dihidroklorida | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 mg / 1 gram |
| Higromisin B (50 mg/mL) | 60224ES03 | 1 gram (20ml)/10×1 gram (20ml) |
| Higromisin B | Nomor telepon 60225ES03/10 | 1/10 gram |
| Eritromisin | Nomor telepon 60228ES08/25 | 5/25 gram |
| Waktu | Nomor telepon 60230ES07/32 | 3,2/10×3.2 gram |
| Aureobasidin A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1 mg |
| Polimiksin B Sulfat | Nomor telepon 60242ES03/10 | 1/10 mililiter |