Teknologi amplifikasi isotermal dapat mencapai tujuan amplifikasi urutan asam nukleat tertentu dalam kondisi suhu konstan. Karena karakteristiknya yang tidak memerlukan peralatan khusus, waktu amplifikasi yang singkat, dan sensitivitas yang tinggi, teknologi ini telah menunjukkan prospek aplikasi yang baik dalam deteksi di tempat dan diagnosis di tempat perawatan dan sangat cocok untuk pengembangan alat diagnostik molekuler.

Dalam konteks pandemi virus corona baru dengan meningkatnya strain dan daya infeksi, teknologi amplifikasi isotermal dapat mendeteksi virus corona baru secara cepat dengan instrumen sederhana, membantu memecahkan masalah bahwa beberapa pasien COVID-19 tidak dapat dikonfirmasi dengan cepat karena waktu deteksi yang lama dan tingginya persyaratan untuk peralatan deteksi dan reagen teknik PCR tradisional. Jadi apa prinsip RT-LAMP, salah satu teknik amplifikasi isotermal? Apa saja bahan baku berkualitas tinggi yang Yeasen dapat menyediakan?

1. Apa prinsip RT-LAMP?
2. Desain primer untuk RT-LAMP
3. Bahan baku apa saja yang bisa Yeasen menyediakan?
4. Panduan Pemilihan Produk

1. Apa prinsip RT-LAMP?

Pada tahun 2000, cendekiawan Jepang Notomi dan lainnya menetapkan teknologi amplifikasi asam nukleat baru yang disebut amplifikasi isotermal termediasi loop (LAMP). LAMP menggunakan 4 primer spesifik yang dirancang untuk 6 wilayah gen target, dan menggunakan DNA polimerase perpindahan untai untuk mengamplifikasi 109 salinan urutan target dalam puluhan menit dalam kondisi isotermal (60～65 ℃). Hasilnya dinilai dengan elektroforesis gel agarosa, dan hasil positif menunjukkan pita berbentuk tangga. LAMP memiliki karakteristik spesifisitas yang kuat, sensitivitas tinggi, operasi cepat dan sederhana, dan biaya rendah. Dengan peningkatan dan penyempurnaan teknologi ini yang berkelanjutan, saat ini digunakan dalam mendeteksi berbagai mikroorganisme patogen.

RT-LAMP merupakan metode penambahan enzim reverse transcriptase ke dalam sistem amplifikasi LAMP, yang dapat mendeteksi langsung RNA virus. Efisiensi amplifikasi LAMP sangat tinggi, sehingga sejumlah besar asam nukleat dapat diamplifikasi hanya dengan sejumlah kecil cDNA. Waktu transkripsi balik dalam proses amplifikasi asam nukleat dapat dihemat, dan kecepatan deteksi RNA pun meningkat.

DNA berada dalam keadaan kesetimbangan dinamis pada sekitar 65℃. Di bawah aksi DNA polimerase perpindahan untai, dimulai dari ujung 3' segmen F2 primer FIP, ia dipasangkan dengan urutan komplementer DNA cetakan untuk memulai sintesis DNA perpindahan untai. Primer F3 komplementer terhadap F3c di ujung depan F2c dan mengambil ujung 3' sebagai titik awal untuk mensintesis DNA-nya sambil mengganti untai DNA yang disintesis oleh primer FIP terkemuka dengan aksi DNA polimerase perpindahan untai. Memanjang ke depan. Untai DNA yang disintesis oleh primer F3 terakhir membentuk untai ganda dengan satu untai DNA cetakan. Untai DNA yang disintesis oleh primer FIP digantikan oleh untai primer F3 untuk menghasilkan untai tunggal. Untai tunggal ini memiliki segmen F1c dan F1 yang komplementer di ujung 5', sehingga pasangan basa sendiri dilakukan untuk membentuk struktur melingkar. Dan primer BIP dihibridisasi dan digabungkan dengan untai tunggal, dan ujung 3' primer BIP digunakan sebagai titik awal untuk mensintesis untai komplementer, dan strukturnya dibuka dalam proses tersebut.Kemudian, primer yang mirip dengan F3 dan B3 disisipkan dari primer BIP, pasangan basa komplementer dilakukan, dan untai komplementer baru disintesis dari ujung 3' sebagai titik awal. Ada sekuens komplementer di kedua ujung DNA untai tunggal yang diganti, dan pasangan basa sendiri terjadi untuk membentuk struktur melingkar, sehingga seluruh rantai menyajikan struktur seperti halter. Struktur ini adalah struktur awal dari siklus amplifikasi metode RT-LAMP.

Dalam struktur berbentuk halter, ekstensi DNA dilakukan dengan menggunakan segmen F1 pada ujung 3' sebagai titik awal dan menggunakan dirinya sendiri sebagai cetakan. Dan primer FIP F2 berhibridisasi dengan F2c untai tunggal pada loop untuk memulai putaran baru reaksi perpindahan untai. Asam nukleat untai ganda yang disintesis dari segmen F1 dipisahkan, dan dengan cara yang sama, struktur melingkar terbentuk pada asam nukleat. Ada bentuk untai tunggal B2c pada struktur melingkar, dan B2 pada primer BIP berhibridisasi dengannya untuk memulai putaran baru amplifikasi, dan struktur melingkar terbentuk melalui proses yang sama. Menurut proses ini, urutan komplementer pada untai yang sama berputar melalui pemasangan, ekstensi untai, dan akhirnya membentuk struktur dengan ukuran yang berbeda.

2. Desain primer untuk RT-LAMP

Desain primer merupakan kunci keberhasilan amplifikasi dan deteksi RT-LAMP. Primer RT-LAMP mencakup dua primer luar (F3 dan B3) dan dua primer dalam (FIP dan BIP). Primer F3: Primer luar hulu, yang terdiri dari wilayah F3, bersifat komplementer terhadap wilayah F3c dari gen target. Primer FIP: primer internal hulu, yang terdiri dari wilayah F2, wilayah F2c pada ujung 3' dari gen target di wilayah F2 bersifat komplementer terhadap wilayah F1c pada ujung 5' dari gen target. Primer BIP: primer internal hilir, yang terdiri dari wilayah B2, wilayah B2 bersifat komplementer terhadap wilayah B2c pada ujung 3' dari gen target, dan memiliki urutan yang sama dengan wilayah B1c pada ujung 5' dari gen target.

Mirip dengan PCR, prinsip desain primer harus memperhatikan faktor-faktor seperti komposisi basa, kandungan GC, dan substruktur. Selain itu, poin-poin berikut harus diperhatikan. Bagian ujung 5' dari primer bagian dalam FIP dan BIP, yaitu F1c dan B1c, umumnya panjangnya 8-50 bp. Panjangnya lebih disukai 15 hingga 25 bp, dan nilai Tm lebih besar daripada nilai Tm F2 dan B2 pada bagian ujung 3'. Bagian ujung 3' dari primer bagian dalam FIP dan BIP, yaitu F2 dan B2, umumnya panjangnya 8-50 bp. Panjangnya lebih disukai 15-25bp, dan nilai Tm konsisten dengan suhu optimum DNA polimerase Bst yang dipilih dalam percobaan. Panjang primer luar F3 dan B3 umumnya 8-50 bp. Panjangnya sebaiknya 15-25 bp, dan nilai Tm-nya lebih kecil daripada F2 dan B2. Saat merancang primer, struktur loop dan ukuran urutan target harus dipertimbangkan. Ketika jumlah basa dalam loop lebih besar dari 40bp dan ukuran urutan target adalah 130-200bp, efisiensi amplifikasi adalah yang tertinggi.

3. Bahan baku apa saja yang bisa Yeasen menyediakan?

3.1 [Peningkatan baru] Yeasen Terbaik Ditambah DNA Polimerase

Yang baru ditingkatkan Hieff™ Bst Plus DNA Polimerase (Kat#14402ES, 14403ES) diperoleh dengan mengekspresikan dan memurnikan gen DNA polimerase Bacillus stearothermophilus bahasa inggris tidak memiliki domain eksonuklease 5′→3′ pada E.coli.Kemampuan perpindahan untai enzim kuat, dan memiliki keunggulan sensitivitas tinggi, efisiensi amplifikasi tinggi, dan toleransi dUTP tinggi, dan dapat digunakan secara luas dalam deteksi patogen secara real-time berdasarkan teknologi amplifikasi isotermal.

3.1.1 Cepat dan sensitivitas tinggi

Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase memiliki sensitivitas tinggi dan dapat mendeteksi gen target hingga 5 salinan. Jumlah templat berada pada tingkat femtogram (fg), dan laju amplifikasi lebih cepat daripada produk pesaing.

Gambar 1. Reaksi RT-LAMP dilakukan dengan Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase (Oranye) dan enzim Bst dari pesaing N (Abu-abu) dan pesaing T (Biru) untuk mengamplifikasi SARS-CoV-2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase selalu dapat mencapai ambang batas lebih cepat daripada produk pesaing, dan laju amplifikasinya lebih cepat.

4. Panduan Pemilihan Produk

Produk yang disediakan oleh Yeasen adalah sebagai berikut:

Tabel 1.Informasi produk