Antibodi DNA DNA polimerase anti-TAQ ganda untuk membantu mengurangi amplifikasi spesifik yang tidak spesifik

Diagnosis molekuler merupakan subbidang yang paling cepat berkembang di bidang IVD. Bidang ini memiliki keunggulan waktu deteksi yang singkat, sensitivitas yang tinggi, dan spesifisitas yang kuat. Bidang ini banyak digunakan dalam diagnosis bersamaan tumor dan skrining penyakit menular dan penyakit genetik. Dalam bidang diagnosis molekuler, PCR bukan hanya platform teknologi yang paling matang dengan pangsa pasar terbesar, tetapi juga teknologi "standar emas" diagnosis klinis. Dalam reaksi PCR tradisional, masalah amplifikasi nonspesifik sering terjadi. Amplifikasi nonspesifik secara langsung memengaruhi interpretasi hasil deteksi dan akan menyebabkan penurunan sensitivitas amplifikasi dan bahkan hasil fragmen target. Bagaimana amplifikasi nonspesifik terjadi dan bagaimana cara menghindarinya secara efektif?

1. DNA Polimerase Konvensional Dapat Menyebabkan Amplifikasi Nonspesifik

2. Hot Start Polymerase Dapat Meningkatkan Spesifisitas Amplifikasi

3. Antibodi Taq Blok Ganda Dapat Meningkatkan Spesifisitas dan Stabilitas Amplifikasi Dua Kali Lipat

4. Tampilan Kinerja YeasenBlok Ganda Taq antibodi

5. Informasi produk

1. DNA Polimerase Konvensional Dapat Menyebabkan Amplifikasi Nonspesifik

Spesifisitas sekuens primer yang buruk merupakan penyebab langsung amplifikasi nonspesifik. Sebagai promotor DNA polimerase konvensional, aktivitas eksonukleasenya dapat memotong sekuens primer DNA selama persiapan sistem PCR, sehingga mengurangi spesifisitas primer.

Selain itu, DNA polimerase konvensional tidak hanya memiliki aktivitas eksonuklease tetapi juga memiliki aktivitas polimerase. Meskipun suhu ekstensi optimal DNA polimerase adalah 72℃, polimerase masih aktif pada suhu ruangan. Oleh karena itu, selama persiapan reaksi PCR dan proses pemanasan awal, primer dapat membentuk ikatan nonspesifik dengan beberapa templat untai tunggal dan meluas di bawah aksi DNA polimerase Taq, yang mengakibatkan amplifikasi sekuens nontarget dan memengaruhi spesifisitas reaksi.

Oleh karena itu, sistem PCR sering dikonfigurasikan di atas es untuk menghambat aktivitas DNA polimerase. Meskipun metode ini sederhana dan murah, metode ini tidak dapat sepenuhnya menghambat aktivitas enzim, sehingga tidak dapat menghilangkan amplifikasi produk nonspesifik.

2. Hot Start Polymerase Dapat Meningkatkan Spesifisitas Amplifikasi

Hot start polymerase merupakan komponen inti dari hot start PCR. Pada suhu ruangan, situs aktif DNA polymerase diblokir oleh pengubah enzim. Hanya setelah denaturasi PCR pada suhu 95℃, pengubah enzim akan hilang dan aktivitas enzim akan dimulai, sehingga menghindari amplifikasi non-spesifik yang disebabkan oleh enzim.

Saat ini, metode modifikasi hot start yang umum digunakan pada DNA polimerase di pasaran terutama meliputi metode kimia, metode ligan, dan metode antibodi. Di antara metode-metode tersebut, efek pemblokiran dari hot start polymerase yang dimodifikasi oleh antibodi adalah yang terbaik, dan kecepatan pelepasan aktivitas enzim cepat, yang dapat sangat mengurangi waktu reaksi PCR. Ini adalah metode modifikasi enzim hot start yang banyak digunakan di pasar IVD.

Namun, perlu dicatat bahwa metode hot start antibodi tradisional hanya memblokir aktivitas polimerase 5'→3' dari polimerase DNA Taq, yang hanya dapat mencegah amplifikasi non-spesifik yang disebabkan oleh ketidakcocokan atau dimer primer pada suhu rendah.Akan tetapi, seperti yang disebutkan di atas, DNA polimerase Taq tidak hanya memiliki aktivitas polimerase 5'→3' tetapi juga memiliki aktivitas eksonuklease 5'→3'. Aktivitas eksonuklease ini dapat menyebabkan degradasi probe yang tidak cocok atau bahan lain pada suhu rendah, sehingga menghasilkan beberapa sinyal yang tidak spesifik.

3. Antibodi Taq Blok Ganda Dapat Meningkatkan Spesifisitas dan Stabilitas Amplifikasi Dua Kali Lipat

Sebagai pemimpin inovatif dalam industri enzim molekuler dalam negeri, Yeasen Bioteknologi (Shanghai) Co., Ltd. (selanjutnya disebut Yeasen) berfokus pada R & D dan produksi bahan baku enzim molekuler dan berani berinovasi. Mengandalkan platform penyaringan antibodi yang matang, ia menyaring antibodi pemblokiran dengan DNA polimerase Taq sebagai molekul target. Setelah bertahun-tahun melakukan penelitian dan pengoptimalan sistem yang melelahkan, ia telah mengembangkan antibodi DNA polimerase anti-Taq blok ganda, Ia tidak hanya dapat memblokir aktivitas polimerase dari polimerase DNA Taq tetapi juga memblokir aktivitas eksonuklease dari polimerase DNA Taq. Dalam pendekatan bercabang dua, ia tidak hanya dapat secara efektif mencegah amplifikasi non-spesifik yang disebabkan oleh ketidakcocokan atau dimer primer, tetapi juga mencegah degradasi material dari menghasilkan sinyal non-spesifik, dan meningkatkan stabilitas reagen dua kali lipat.

4. Tampilan Kinerja YeasenBlok Ganda Taq antibodi

4.1 Penggunaan Antibodi Taq Blok Ganda Akurat dan Lebih Sensitif

Setelah memblokir polimerase Taq dengan Yeasenantibodi blok ganda 's dan antibodi perusahaan T, sampel positif dideteksi oleh ARMS-PCR.

Gambar 1. Kurva amplifikasi ARMS-PCR; Biru: Antibodi pemblokiran perusahaan T; Merah: Yeasenantibodi blok ganda 's

Dari Gambar 1 dapat dilihat bahwa Taq polymerase yang diblok oleh YeasenAntibodi blok ganda memiliki pengetikan yang akurat dan sensitivitas yang lebih tinggi dalam amplifikasi ARMS-PCR.

4.2 Antibodi Taq Blok Ganda Secara Efektif Memblokir Aktivitas Eksonuklease dari Taq DNA Polimerase

Probe primer yang disintesis dicocokkan dengan larutan reaksi polimerase DNA Taq yang diblokir oleh antibodi yang tidak tertutup dan yang diblokir ganda dan direaksikan pada suhu 40℃ untuk mendeteksi sinyal fluoresensinya.

Gambar 2. Deteksi efisiensi pemblokiran antibodi blok ganda terhadap aktivitas eksonuklease; Kuning: kelompok polimerase DNA Taq yang tidak tertutup; Ungu: Kelompok DNA polimerase Taq diblokir oleh antibodi blok ganda

Hal ini dapat dilihat pada gambar 2 bahwa antibodi blok ganda dapat secara efektif memblokir aktivitas eksonuklease dari DNA polimerase Taq.

4.3 Antibodi Taq Blok Ganda Dapat Secara Efektif Meningkatkan Stabilitas Reagen Deteksi

Taq DNA polimerase diblokir dengan antibodi pemblokiran tradisional dan antibodi blok ganda dan dikonfigurasikan menjadi premix lengkap yang mengandung probe primer. 10.000 salinan plasmid ASF diamplifikasi pada suhu 4℃ selama 10 hari atau pada suhu 37℃ selama 1, 3, dan 5 hari. Kurva amplifikasi dan perubahan nilai Ct diamati, dan efek antibodi pemblokiran tradisional dan antibodi blok ganda pada stabilitas larutan reaksi premix lengkap dibandingkan.

Gambar 3.Kurva amplifikasi 10000 salinan plasmid ASF yang diperkuat dengan larutan reaksi pemblokiran antibodi pemblokiran tradisional (a) dan antibodi pemblokiran ganda (b); Biru: simpan pada suhu 4℃ selama 10 hari; Merah: ditempatkan pada suhu 4℃ selama 0 hari (kontrol)

Dapat dilihat dari Gambar 3 bahwa antibodi blok ganda dapat menjaga kestabilan larutan reaksi dan secara efektif meningkatkan kestabilan reagen deteksi daripada antibodi pemblokiran tradisional. Kurva amplifikasi dan nilai Ct tidak berubah secara signifikan setelah seluruh premix yang mengandung probe primer diblokir oleh antibodi blok ganda dan ditempatkan pada suhu 4℃ selama 10 hari.

Gambar 4. Kurva amplifikasi 10.000 salinan plasmid ASF yang diamplifikasi dengan larutan reaksi pemblokiran antibodi penghambat tradisional (a) dan antibodi penghambat ganda (b); Biru: simpan pada suhu 37℃ selama 5 hari; Hijau: 37℃ selama 3 hari; Kuning: 37℃ selama 1 hari; Merah: ditempatkan pada suhu 37℃ selama 0 hari (kontrol)

Dapat dilihat dari Gambar 4 bahwa antibodi blok ganda dapat menjaga kestabilan larutan reaksi dan secara efektif meningkatkan kestabilan reagen deteksi daripada antibodi pemblokiran tradisional. Antibodi blok ganda memblokir seluruh premix yang mengandung primer-probe, dan perbedaan nilai Ct kurang dari 0,2 setelah ditempatkan pada suhu 37℃ selama 1, 3, dan 5 hari.

4.4 Antibodi Taq Blok Ganda Membantu Memecahkan Masalah Penyimpangan Baseline

Ketika beberapa primer bekerja sama dengan buffer dan instrumen tertentu, akan terjadi pergeseran garis dasar. Yeasen mencoba banyak metode untuk memperbaiki masalah garis dasar dan menemukan bahwa antibodi blok ganda lebih kondusif untuk garis dasar yang stabil.

Gambar 5. Kurva amplifikasi gen N (a) dan gen ACT (b); Merah: antibodi pemblokiran tradisional; Hijau: antibodi blok ganda

Seperti dapat dilihat pada Gambar 5, penggunaan antibodi blok ganda di bawah primer dan penyangga spesifik dapat membantu memecahkan masalah pergeseran garis dasar.

4.5 Linearitas Baik Diperoleh Menggunakan Antibodi Taq Blok Ganda

100000, 10000, 1000, dan 100 salinan plasmid ganda ASF/ACT diperkuat dengan larutan reaksi yang diblokir oleh antibodi blok ganda, dan kurva standar dibuat.

Gambar 6. Kurva standar gen ASF (a) dan gen ACT (b) yang dihasilkan dari reaksi blok ganda larutan

Seperti yang dapat dilihat pada Gambar 6, kurva standar R2 gen ASF adalah 0,998, dan efisiensi amplifikasi adalah 98,848%; Kurva standar R2 gen ACT adalah 0,998 dan efisiensi amplifikasinya sebesar 98,113%.

4.6 Blok Ganda Taq Antibodi Dapat Melepaskan Aktivitas Enzim dengan Cepat

Polimerase Taq diblokir dengan antibodi perusahaan T yang diimpor dan Yeasenantibodi blok ganda (cat#31303) masing-masing, dan aktivitas enzim terdeteksi setelah kejutan panas pada suhu 95℃ selama 20 detik. Dapat dilihat bahwa 31303 dapat melepaskan lebih dari 95% aktivitas enzim setelah kejutan panas pada suhu 95℃ selama 20 detik, yang setara dengan antibodi perusahaan T.

Tabel 1. Aktivitas Enzim

4.7 Blok Ganda Taq Antibodi Dapat Memblokir Banyak Jenis Enzim Taq

Tiga jenis enzim Taq (tipe liar dan 2 mutan) diblokir oleh Yeasenantibodi blok ganda (cat#31303), dan rasio pemblokiran adalah 1 μ g: 5 U, mengukur nilai fluoresensi dan efisiensi penyegelan. Dapat dilihat bahwa efek pemblokiran YeasenAntibodi blok ganda (cat#31303) lebih baik untuk berbagai jenis enzim Taq.

Tabel 2. Efisiensi pemblokiran berbagai jenis enzim Taq

4.8 Yeasen'S Antibodi Taq Blok Ganda Tidak Memiliki Residu Genom pada Tikus

Dengan mengambil air sebagai cetakan untuk kontrol negatif dan genom tikus sebagai cetakan untuk kontrol positif, 31.303 kelompok berbeda diamplifikasi. Ditemukan bahwa fragmen target tidak diamplifikasi dalam sampel, yang menunjukkan bahwa tidak ada residu genom tikus dalam antibodi.

Gambar 7. Diagram deteksi residu genom tikus

Catatan: - adalah kontrol negatif, + adalah kontrol positif, dan 1-5 adalah 31303 sampel dari batch yang berbeda

5. Informasi produk