Amplifikasi nonspesifik dari Taq DNA polimerase merupakan masalah umum dalam percobaan PCR, yang secara langsung mempengaruhi interpretasi hasil deteksi dan dapat menyebabkan penurunan sensitivitas amplifikasi, dan bahkan pengurangan hasil fragmen target. Memanfaatkan pengubah enzim untuk menyegel pusat aktif Taq DNA polimerase pada suhu ruangan, sehingga menghambat aktivitas DNA polimerase enzim Taq pada suhu ruangan, saat ini merupakan metode yang paling efektif untuk menekan amplifikasi nonspesifik. Antibodi penyegel ganda yang dikembangkan oleh Yisheng tidak hanya menyegel aktivitas polimerase Taq DNA polimerase tetapi juga secara bersamaan menyegel aktivitas eksonuklease Taq DNA polimerase. Pendekatan ganda ini secara efektif mencegah amplifikasi nonspesifik yang disebabkan oleh kesalahan pemasangan atau dimer primer dan juga mencegah pembentukan sinyal nonspesifik karena degradasi material, sehingga meningkatkan spesifisitas reagen dua kali lipat. Hal ini memungkinkan reagen deteksi untuk mengatasi transportasi atau penggunaan suhu ruangan dengan mudah.

1.Spesifisitas amplifikasi ultra-tinggi—Antibodi tersegel ganda dapat secara bersamaan menyegel aktivitas polimerase dan eksonuklease, secara efektif menghindari amplifikasi nonspesifik dan meningkatkan spesifisitas.

2.Sensitivitas deteksi yang luar biasa—Formulasi hot-start memastikan deteksi efektif gen berkelimpahan rendah, menawarkan sensitivitas yang lebih tinggi.

3.Stabilitas produk yang luar biasa—Kinerjanya stabil saat ditempatkan pada suhu 37°C selama 5 hari atau pada suhu 4°C selama 10 hari.

4.Stabilitas dasar dan linearitas yang baik—Mengatasi masalah pergeseran dasar, menghasilkan linearitas yang sangat baik.

5.Pelepasan aktivitas enzim yang cepat—Lebih dari 95% aktivitas enzim dapat dilepaskan dengan pemanasan pada suhu 95°C selama 20 detik.

6.Penerapan enzim yang luas—Cocok untuk enzim Taq tipe liar dan mutan, dengan setiap mg antibodi mampu menyegel 4-10 KU enzim Taq.

1 Pemblokiran aktivitas eksonuklease DNA polimerase Taq

Probe primer sintetis masing-masing dimasukkan ke dalam campuran reaksi DNA polimerase Taq yang dibuka atau ditutup dengan antibodi penutupan ganda, dan reaksi dilakukan pada suhu 40°C. Sinyal fluoresensi keduanya terdeteksi, dan ditemukan bahwa antibodi penutupan ganda dapat secara efektif menutup aktivitas eksonuklease DNA polimerase Taq.

Gambar 2. Deteksi efisiensi penyegelan aktivitas antibodi-endonuklease yang disegel ganda.

tanggal 02 Verifikasi sensitivitas deteksi

Masing-masing menggunakan Yeasenantibodi double-sealed 's dan antibodi Perusahaan T untuk menyegel enzim Taq, diikuti dengan deteksi sampel positif melalui teknologi ARMS-PCR, ditemukan bahwa enzim Taq disegel oleh YeasenAntibodi tersegel ganda akurat dalam amplifikasi ARMS-PCR dengan sensitivitas lebih tinggi.

Merah:Yeasen antibodi + TaqBahasa Indonesia: Biru: pemasok antibodi A + Taq.

Gambar 3. Kurva amplifikasi ARMS-PCR.

tanggal 03 Verifikasi Stabilitas (4°C selama 10 hari, 37°C selama 5 hari).

Dengan menggunakan antibodi tertutup tradisional dan antibodi tertutup ganda untuk masing-masing memblokir DNA polimerase Taq, polimerase tersebut kemudian diformulasikan menjadi larutan premiks lengkap yang berisi primer dan probe. Larutan ini dibiarkan pada suhu 4°C selama 10 hari atau pada suhu 37°C selama 1, 3, dan 5 hari, lalu digunakan untuk mengamplifikasi 10.000 salinan plasmid ASF. Diamati bahwa tidak ada perubahan signifikan pada kurva amplifikasi dan nilai Ct.

Gambar 4. Kurva amplifikasi 10.000 salinan plasmid ASF setelah polimerase Taq diblokir dengan antibodi pemblokiran tradisional (A) dan antibodi pemblokiran ganda (B), diperkuat dengan sistem qPCR.

tanggal 04 Deteksi Garis Dasar

Dalam kondisi tertentu di mana primer tertentu digunakan bersama dengan buffer dan instrumen tertentu, fenomena yang dikenal sebagai pergeseran garis dasar dapat terjadi. Namun, penggunaan antibodi tertutup ganda dapat secara efektif mengatasi masalah pergeseran garis dasar, sehingga memfasilitasi garis dasar yang lebih stabil.

Gambar 5. Kurva amplifikasi gen SARS-CoV-2 N (A) dan gen ACT (B) dalam analisis qPCR.

tanggal 05 Verifikasi Linearitas

Campuran reaksi yang disegel dengan antibodi tertutup ganda digunakan untuk mengamplifikasi 100.000, 10.000, 1.000, dan 100 salinan plasmid ganda ASFV/ACT untuk menghasilkan kurva standar. Seperti yang dapat dilihat dari Gambar 7, keduanya menunjukkan linearitas yang baik.

Gambar 6. Grafik kurva standar untuk gen ASFV dan gen ACT yang dihasilkan menggunakan campuran reaksi blok ganda.

tanggal 06 Uji Pelepasan Aktivitas Enzimatik

Menggunakan antibodi tertutup ganda (Cat#31303) dari Yeasen untuk menyegel enzim Taq, dan dengan memberikan kejutan termal pada suhu 95°C selama 20 detik, aktivitas enzimatik terdeteksi. Dapat diamati bahwa setelah kejutan termal selama 20 detik pada suhu 95°C, 31303 dapat melepaskan lebih dari 95% aktivitas enzimatik, yang sebanding dengan antibodi dari Perusahaan T.

Tabel 1. Kejutan panas pada suhu 95°C selama 20 detik enzim.

tanggal 07 Deteksi Polimerase Taq Multipleks

YeasenAntibodi double-closed (Cat#31303) digunakan untuk menyegel tiga jenis polimerase Taq (tipe liar + dua tipe mutan), dengan rasio penyegelan 1μg hingga 5U, dan nilai fluoresensi serta efisiensi penyegelan diukur. Ditemukan bahwa untuk berbagai jenis polimerase Taq, YeasenAntibodi tertutup ganda (Cat#31303) menunjukkan efek penyegelan yang baik.

Tabel 2. Efisiensi terblokir dari berbagai jenis polimerase Taq.