Diagnostik molekuler adalah metode dan proses untuk membuat diagnosis spesifik terhadap kondisi atau penyakit manusia dengan memeriksa keberadaan, cacat, atau ekspresi abnormal gen endogen atau gen eksogen (patogen) di dalam tubuh manusia, menggunakan molekul DNA, RNA, atau protein sebagai bahan diagnostik. Teknologi diagnostik molekuler utama meliputi Polymerase Chain Reaction (PCR), Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), gene chips, dan teknologi sequencing gen. Dibandingkan dengan teknologi hibridisasi dan sequencing berthroughput tinggi, keunggulan utama teknologi PCR adalah sensitivitasnya yang lebih tinggi, spesifisitas yang lebih kuat, kemudahan pengoperasian, dan kemudahan penyebaran. Meskipun teknologi PCR memiliki keterbatasan tertentu dalam jumlah gen yang dapat dideteksinya, dalam jangka pendek, teknologi ini akan terus menjadi teknologi utama dalam diagnostik molekuler.
Alur kerja amplifikasi PCR diagnostik molekuler dan ikhtisar bahan baku
1、Bahan enzim inti-Taq DNA Polimerase
Karena perluasan bidang pengujian aplikasi dan peningkatan permintaan pasar, DNA polimerase Taq tipe liar tidak lagi dapat sepenuhnya memenuhi persyaratan.
- Stabilitas Unggul: Diformulasikan menjadi larutan premix lengkap yang mengandung primer dan probe, setelah perlakuan pada suhu 37°C selama 7 hari, tidak ada perubahan dalam deteksi konsentrasi rendah.
Gambar 1: Menggunakan asam nukleat HBV sebagai templat, larutan premix lengkap qPCR disiapkan dengan 10726ES, dan semua komponen kecuali templat diuji untuk stabilitas yang dipercepat pada suhu 37°C selama 7 hari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada perubahan signifikan pada nilai Ct dan nilai fluoresensi pada konsentrasi tinggi, sedang, dan rendah, yang menunjukkan bahwa larutan premix yang disiapkan dengan 10726ES memiliki kinerja yang stabil.
- Residu gDNA inang rendah: DNA genom E. coli yang tersisa kurang dari 0,5 salinan per 100 U.
Gambar 2: Kisaran linier DNA genom E. coli: 30 fg/μL hingga 300 pg/μL, dengan koefisien korelasi R2 sebesar 0,9999. (B) Sisa DNA genom E. coli dalam tiga kelompok Hieff UCF.ME® Sensitive Taq DNA Polymerase kurang dari 0,5 salinan per 100 U.
2. Bahan enzim inti-Reverse Transcriptase
Sebagai salah satu komponen kunci reaksi RT-qPCR, reverse transcriptase harus memiliki kecepatan reverse transkripsi yang lebih cepat, hasil sintesis yang lebih tinggi, dan ketahanan panas yang lebih baik. Untuk mendapatkan reverse transcriptase yang lebih cocok untuk RT-qPCR,
- Dapat menahan suhu reaksi 58℃ dan cocok untuk transkripsi balik templat RNA kompleks
Gambar 3: Hifair® V Reverse Transcriptase dan reverse transcriptase T* merek impor diinkubasi pada suhu 55°C dan 58°C selama 30 menit untuk mendeteksi aktivitas enzim yang tersisa. Hasilnya menunjukkan bahwa Hifair® V Reverse Transcriptase mempertahankan aktivitas 70% setelah inkubasi pada suhu 58°C selama 30 menit, jauh melebihi merek impor.
- Tingkat deteksi yang lebih unggul dalam RT-qPCR dibandingkan dengan merek lain, dengan rentang deteksi 1 pg hingga 1 μg
Gambar 4: Menggunakan total RNA sel 293T pada konsentrasi mulai dari 1 pg hingga 1 μg (7 gradien) sebagai templat, transkripsi balik dilakukan menggunakan pencernaan RT-gDNA Hifair® V one-step SuperMix untuk qPCR (Cat#11142), V*, dan T*. cDNA yang dihasilkan kemudian dikenakan qPCR untuk analisis kuantitatif. Hasilnya menunjukkan bahwa sensitivitas 11142ES dapat mencapai 1 pg, dengan tingkat deteksi yang lebih unggul daripada produk pesaing.
3. Enzim dan Inhibitor Enzim Lainnya: Inhibitor RNase, Enzim UDG
RNase penghambat: Bahasa Indonesia:
Urasil DNA Glikosilase (enzim UDG/UNG)Uracil-DNA glycosylase (enzim UDG), bila digunakan bersama dUTP, dapat membentuk sistem pencegahan kontaminasi PCR. Enzim UDG rendah dan termolabil Yisheng dapat menghindari aktivitas residu enzim UDG konvensional setelah inaktivasi, yang dapat menyebabkan degradasi produk amplifikasi yang mengandung dU pada suhu ruangan. Enzim ini juga mencegah hasil positif palsu pada hasil PCR yang disebabkan oleh bakteri latar belakang yang terdapat dalam enzim molekuler. Hal ini penting untuk mengidentifikasi patogen infeksius secara akurat dan membantu diagnosis klinis infeksi dan penyakit infeksius.
Antibodi DNA Polimerase Taq:Amplifikasi nonspesifik merupakan salah satu masalah utama yang secara signifikan memengaruhi kinerja PCR, dan teknologi hot start dapat secara efektif mengurangi amplifikasi nonspesifik. Enzim hot start yang dimodifikasi dengan antibodi memiliki efisiensi penyegelan yang tinggi dan kinerja yang sangat baik, stabil pada suhu ruangan dengan laju pelepasan aktivitas enzim yang cepat.Enzim Taq hot start antibodi ganda yang dikembangkan oleh Yisheng Biotech tidak hanya menyegel aktivitas polimerase 5'→3' dari enzim Taq tetapi juga secara bersamaan menyegel aktivitas eksonuklease 5'→3'. Pendekatan ganda ini secara efektif mencegah amplifikasi nonspesifik yang disebabkan oleh kesalahan pemasangan atau dimer primer dan juga mencegah pembentukan sinyal nonspesifik karena degradasi probe atau primer, sehingga meningkatkan stabilitas reagen dua kali lipat.
4、Campuran Master qPCR Satu Tabung Berkinerja Tinggi Universal
- fleksibilitas yang baik：Cocok untuk berbagai jenis primer dan probe (lebih dari 40 jenis target telah diverifikasi), dan memiliki kinerja amplifikasi yang sangat baik;
- aku Stabilitas premix super penuh: stabil pada suhu 37℃ selama 14 hari, 4℃ selama 28 hari, pembekuan dan pencairan berulang sebanyak 50 kali;
- Sensitivitas tinggi dan spesifisitas baik: Sensitivitasnya dapat mendeteksi 0,25 salinan/μL, dan spesifisitas 48 lubang tidak memiliki puncak negatif；
- Mendukung program cepat:kompatibel dengan program cepat, 30 menit dapat menghasilkan hasil;
- sistem anti polusi dUP/UDG: Sistem antipolusi dUTP/UDG diperkenalkan untuk mencegah polusi aerosol secara efektif;
- Aplikasi multi-platform dan multi-sistem: Bio-Rad CFX96, ABI Q5, 7500, Slan, Tianlong, dll.
Gambar 5: Berdasarkan studi stabilitas reagen pracampur all-in-one, 16710ES diperlakukan dengan tiga cara berbeda (4°C, 37°C, dan siklus beku-cair). Kelompok eksperimen diperlakukan pada suhu 4°C dan 37°C selama 7 hari, masing-masing, dan mengalami 50 siklus beku-cair, sedangkan kelompok kontrol (disimpan pada suhu -20°C) dievaluasi stabilitasnya di bawah empat sistem amplifikasi multipleks (Kelompok 1, 2, dan 4 adalah sistem amplifikasi quadruplex, dan Kelompok 3 adalah sistem amplifikasi triplex). Hasil penelitian menunjukkan bahwa deviasi nilai Ct (ΔCt) antara kelompok eksperimen dan kontrol berada dalam kisaran ±0,5, dan deviasi nilai fluoresensi berada dalam kisaran 15%, membuktikan bahwa
5、Campuran Master RT-qPCR Berkinerja Tinggi Universal
Reagen RT-qPCR satu langkah memadukan kinerja unggul enzim reverse transcriptase dan hot-start, dilengkapi dengan sistem penyangga yang dioptimalkan, yang memungkinkan deteksi cepat dan sensitif terhadap templat salinan satu digit. Divalidasi oleh berbagai pasar pelanggan termasuk penyakit pernapasan, epidemi hewan, dan sistem penelitian, reagen ini dapat memenuhi kebutuhan berbagai arah aplikasi.
- fleksibilitas yang baik：Sangat cocok untuk amplifikasi qPCR dan deteksi asam nukleat mikroorganisme patogen, genom manusia, tanaman, dan spesies lainnya；
- Sensitivitas tinggi：Sistem penyangga yang dioptimalkan dengan cermat meningkatkan sensitivitas deteksi templat konsentrasi rendah hingga 250 salinan/mL；
- Sistem anti polusi dUP/UDG：Sistem anti-polusi UDG yang labil terhadap panas/dUTP diperkenalkan untuk menurunkan polusi aerosol pada produk secara efisien, mengurangi positif palsu, dan memastikan hasil yang autentik；
- Mendukung program cepat: kompatibel dengan program cepat, 40 menit dapat menghasilkan hasil;
- Stabilitas super: stabil pada suhu 37℃ selama 14 hari, pembekuan dan pencairan diulang 10 kali.
Evaluasi sensitivitas deteksi
Gambar 6: Pemanfaatan
Rekomendasi produk
| 产品类型 | 产品名称 | 货号 |
| Seri enzim PCR | Hieff UNICON® Hotstart E-Taq DNA Polimerase, 5 U/μL | 10726ES |
| Hifair® V Transkriptase Terbalik (200 U/μL) | 11300ES | |
| Uracil DNA Glikosilase (UDG/UNG), tidak tahan panas, 1 U/μL | 10303ES | |
| Penghambat RNase Murine (40 U/µL) | 10603ES | |
| Campuran dNTP (masing-masing 25 mM) | 10125ES | |
| Seri enzim tunggal PCR ultra-bersih dengan residu host ultra-rendah | Hieff UCF.ME® Hotstart Sensitive Taq DNA Polimerase (5 U/μL) | 14314ES |
| Hifair UCF.ME® V Transkriptase Terbalik (200 U/μL) | 14608ES | |
| UCF.ME® Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), tidak tahan panas, 1 U/μL | 14466ES | |
| UCF.Penghambat RNase Murine ME® (40 U/µL) | 14672ES | |
| Seri monoenzim PCR Lyo-Ready | Hieff UNICON® HotStart E-Taq DNA Polimerase, Bebas Gliserol (5U/μL) | 14316ES |
| Hifair® V Reverse Transcriptase, Bebas Gliserol (600 U/μL) | 11301ES | |
| Uracil DNA Glycosylase (UDG), Tahan Panas (1 U/μL, Bebas Gliserol) | 10707ES | |
| Inhibitor RNase murine (200 U/µL, Bebas gliserol) | 10703ES | |
| Campuran Master RT-qPCR | Kit Probe RT-qPCR Satu Langkah Multiplex Hifair® C203P1 (UDG Plus) | 16630ES |
| Kit Probe RT-qPCR Satu Langkah Hifair® V Multiplex (UDG Plus) | 11899ES | |
| Kit RT-qPCR Satu Langkah Hifair® Lyo Multiplex | 11831ES | |
| Campuran Master qPCR | Hieff Unicon® Universal TaqMan Pro U+ qPCR Mix (Satu Tabung) | 16710ES |
| Campuran Master Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR (UDG plus) | 13891ES | |
| Campuran Master Hieff Unicon® Superpro II TaqMan qPCR（UDG plus） | 11827ES | |
| Campuran Master Hieff Unicon® Purepro II TaqMan qPCR（UDG plus） | 11853ES | |
| Campuran Master Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR (UDG plus) | 11893ES |