Seiring dengan terus berkembangnya penelitian medis, terapi terarah menjadi lebih matang. Dasar dari pengobatan terarah adalah melakukan pengujian genetik pada target molekuler obat-obatan untuk mengidentifikasi mutasi gen yang menyebabkan kelainan atau keganasan keturunan. ARMS-PCR adalah metode baru berdasarkan PCR yang dapat mendeteksi banyak mutasi titik DNA. Saat ini, metode ini merupakan salah satu metode yang paling penting dan tersebar luas untuk identifikasi genetik kanker yang disesuaikan. Manfaat penggunaan terapeutiknya telah diakui dengan baik oleh para ahli di lapangan.

1. Bagaimana cara kerja PCR spesifik alel?
2. Bagaimana cara meningkatkan spesifisitas ARMS?
3. Apa saja fitur produk yang disediakan oleh Yeasen....
4. Apa itu data kinerja produk?
5. Bagaimana orang memesan produk?

1. Bagaimana cara kerja PCR spesifik alel?

ARMS-PCR adalah Amplification Refractory Mutation System PCR (ARMS-PCR), yang juga dikenal sebagai Allele-Specific PCR (AS-PCR). Ekstensi spesifik alel diatur untuk mengidentifikasi alel tipe liar dan gen tipe liar mutan, dan nilai sinyal fluoresensi diukur menggunakan teknik probe Taqman.
Primer PCR ARMS dirancang dengan nukleotida yang berbeda pada ujung 3' dari dua primer hulu alel, dan kedua primer tersebut, masing-masing, spesifik untuk tipe liar dan tipe mutan. Selama amplifikasi, primer hulu yang tidak sepenuhnya cocok dengan templat tidak dapat membentuk pasangan basa komplementer, sehingga mengakibatkan ketidakcocokan, ekstensi terhambat, dan ketidakmampuan untuk menghasilkan produk PCR, sedangkan sistem primer yang cocok dengan templat dapat mengamplifikasi produk PCR yang sesuai. Fluorofor pada probe Taqman dapat memancarkan sinyal fluoresensi yang dapat dideteksi oleh perangkat, dan genotipe dapat divalidasi dengan mengevaluasi data fluoresensi.
Teknologi ARMS memiliki sensitivitas tinggi, batas deteksi dapat mencapai 100 salinan/mL, dan batas deteksi untuk jaringan tumor dapat mencapai tingkat mutasi 0,5%. Selain itu, ARMS memakan waktu dan biaya rendah, dan hasilnya intuitif dan mudah dinilai. Ini karena ARMS yang dikombinasikan dengan teknologi qPCR atau elektroforesis hanya memerlukan satu reaksi PCR, yang membutuhkan waktu lebih sedikit. Hanya primer hulu yang perlu dioptimalkan untuk teknologi ARMS, yang memiliki biaya lebih rendah dan hasil intuitif dibandingkan dengan teknologi PCR waktu nyata menggunakan probe MGB. Karena sebagian besar DNA yang diekstraksi dari spesimen jaringan yang tertanam dalam parafin terfragmentasi, hasil deteksi yang akurat tidak dapat diperoleh. Metode ARMS dirancang untuk meminimalkan panjang produk target, dengan demikian mengatasi kesulitan ini dalam jaringan yang tertanam dalam parafin. Pada saat yang sama, ARMS yang dikombinasikan dengan platform PCR mewujudkan operasi tabung tertutup, yang mudah dioperasikan dan tidak memerlukan pasca-pemrosesan produk, sehingga menghindari kontaminasi produk amplifikasi semaksimal mungkin.
Secara teoritis, DNA polimerase Taq harus sepenuhnya komplementer terhadap templat yang tersisa di ujung 3' primer untuk melakukan polimerisasi yang efisien. Namun, kekencangan DNA Taq dipengaruhi oleh beberapa faktor. Dalam beberapa kasus, ekstensi dapat berlanjut bahkan jika basa terminal 3' primer tidak komplementer terhadap templat. Jika hanya ada satu ketidakcocokan basa di ujung 3', primer dapat tidak cocok dan diperpanjang, tetapi efisiensi ekstensi rendah. Dislokasi ujung 3' yang berbeda memiliki efisiensi ekstensi yang berbeda. Jika basa tidak cocok lainnya diperkenalkan di ujung 3', jumlah ketidakcocokan terlalu besar, dan ujung 3' tidak dapat diperpanjang setelah tingkat tertentu.Oleh karena itu, hanya satu ketidakcocokan basa pada ujung 3' primer tidak dapat membedakan kedua alel secara memadai, sehingga menghasilkan hasil positif palsu.

2. Bagaimana cara meningkatkan spesifisitas ARMS?

Fokus peningkatan spesifisitas ARMS adalah untuk meningkatkan spesifisitas ekstensi primer. Basa yang tidak cocok dapat dimasukkan pada basa ke-2 atau ke-3 dari ujung 3'. Basa yang tidak cocok tersebut bekerja bersama dengan basa yang tidak cocok pada ujung 3', dan pada cetakan yang tidak komplementer dengan ujung 3', laju produk amplifikasi primer berkurang. Sementara primer beramplifikasi secara normal pada cetakan yang komplementer dengan ujung 3'-nya, jenis basa yang tidak cocok pada primer bergantung pada jenis ketidakcocokan basa pada ujung 3'.
Setelah primer spesifik untuk ARMS dirancang, sepasang probe TaqMan untuk transfer energi resonansi fluoresensi spesifik-alel diperlukan. Probe TaqMan memiliki dua pewarna fluoresensi, ujung 5' adalah gen fluoresensi, dan ujung 3' memiliki gen pemadaman fluoresensi umum. Dalam probe lengkap, gen pemadam dan gen fluorogenik secara spasial sangat berdekatan, sehingga menyebabkan pemadaman fluoresensi. Dalam keadaan normal, fluoresensi yang dipancarkan oleh fluorofor di ujung 5' tidak dapat dideteksi, dan hanya fluoresensi latar belakang pemadam di ujung 3' yang dapat dideteksi. Dalam proses amplifikasi gen target, baik primer PCR maupun probe berlabel fluoresensi akan saling melengkapi dengan urutan target selama de-OR. Ketika enzim Taq menemukan probe yang terikat secara stabil pada templat saat memperpanjang untai templat, eksonuklease 5'-3' dari enzim Taq akan mendegradasi probe spesifik yang terikat pada templat. Fluorofor pada probe dipisahkan oleh ruang fisik, efek pemadaman menghilang, dan fluoresensi dipancarkan. Ketidakcocokan antara probe berfluoresensi lemah dan urutan target akan mengurangi jumlah fluoresensi yang dilepaskan.

Gambar 1 Konsep dasar ARMS-PCR

3. Apa saja fitur produk yang disediakan oleh Yeasen....

Yeasen Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix merupakan kit yang didasarkan pada konsep blok amplifikasi yang memungkinkan genotipe yang dimediasi ARMS-PCR secara efisien.

👍Selektivitas tinggi: mampu mengidentifikasi beberapa mutasi gen；
👍Sensitivitas tinggi: primer mutan dapat mendeteksi mutasi pada konsentrasi serendah 0,5% dalam 10ng/L DNA;
👍Mudah dibaca: Hasilnya jelas dan dinilai secara objektif, dan itu sederhana dan tidak rumit；
👍Mudah dioperasikan: Kompatibel dengan berbagai peralatan PCR, mode operasinya terstandarisasi, dan deteksi terpasang dapat diselesaikan dalam waktu 90 menit.

4. Apa itu data kinerja produk?

4.1 Dampak penyumbatan produk superior

Percobaan: 5L masukan template, 10ng/L template tipe liar, dan jumlah plasmid mutan yang setara diperkuat menggunakan primer mutan.
Situs：KRASG13D（38G>A）
Merah：13755；Biru: Pesaing

Gambar 2 menunjukkan bahwa primer tipe liar mengamplifikasi templat tipe liar dan mutan. Menurut kurva amplifikasi, templat tipe liar tidak memiliki puncak atau perbedaan nilai Ct antara tipe liar dan mutan adalah 6-8, sehingga gen tipe liar dan mutan dapat dibedakan secara efektif.

4.2 Tingkat deteksi produk dapat mencapai 0,05%

Percobaan 1: Teknik persiapan standar pencampuran sendiri (50%): 50μL 10ng/μL DNA tipe liar dan 50μL 3X103 salinan plasmid mutan.
Situs：KRASG13D(38G>A)

Gambar 3. Berdasarkan kurva amplifikasi, produk tetap beroperasi secara efektif pada konsentrasi 0,05%

Percobaan 2: Standar 5% yang dibeli (50ng/μL) diencerkan dengan pengencer perpustakaan hingga 10ng/μL, lalu diencerkan lebih lanjut dengan 10ng/μL 293g DNA hingga 0,1% dan 0,05%.
Situs：L858R
Merah：13755；Biru: Pesaing

Gambar 4: Menurut kurva amplifikasi, tingkat deteksi lokus terhadap latar belakang gDNA tipe liar 10 ng/μL dapat mencapai 0,05%, dan validasi selanjutnya dengan standar komersial menunjukkan bahwa produk kami memiliki tingkat deteksi yang sangat baik.

4.3 Stabilitas produk yang sangat baik

Efek amplifikasi dan pemblokiran produk tidak terpengaruh oleh 10 siklus pembekuan dan pencairan.
Percobaan: merah: -20℃; hijau: beku-cair asli 5 kali; biru: beku-cair asli 8 kali; ungu: beku-cair asli 10 kali.
Situs：L858R

Gambar 5 menunjukkan bahwa pembekuan dan pencairan reagen 13755 yang diulang sepuluh kali tidak mempunyai pengaruh terhadap sifat amplifikasi dan pemblokirannya.

Efek amplifikasi dan pemblokirannya tidak terpengaruh oleh suhu 37 °C selama 7 hari.
Percobaan: Merah: -20°C; Hijau & Ungu: 37°C selama 7 hari.
Situs：L858R

Gambar 6 menunjukkan bahwa tujuh hari pada suhu 37°C tidak berpengaruh pada aksi amplifikasi dan pemblokiran reagen 13755.

5. Bagaimana orang memesan produk?

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., didirikan pada tahun 2014, merupakan perusahaan teknologi tinggi yang bergerak di bidang R&D dan produksi bahan baku enzim alat dan antibodi antigen. Produknya meliputi enzim diagnostik molekuler, protein, dan antibodi yang digunakan dalam farmasi, pengujian keamanan pangan, pembiakan, peradilan, dan industri lainnya. Kami berkomitmen untuk menyediakan produk dan layanan berkualitas tinggi kepada pelanggan di bidang ilmu hayati. Produk yang Yeasen dapat menyediakan sebagai berikut:

Tabel 1: Produk yang disediakan oleh Yeasen