Kisaran nilai CT yang masuk akal dalam percobaan qPCR

Nilai Ct merupakan representasi hasil yang penting dalam PCR kuantitatif fluoresensi. Nilai ini digunakan untuk menghitung perbedaan tingkat ekspresi gen atau jumlah salinan gen. Jadi, berapa kisaran nilai Ct yang dapat dianggap wajar dalam kuantisasi fluoresensi? Bagaimana kita dapat memastikan bahwa nilai Ct berada dalam kisaran yang efektif? Hari ini, mari kita biarkan Xiao Yi menjawab pertanyaan ini untuk semua orang.

Apa itu nilai Ct?

Dalam proses amplifikasi qPCR, nilai Ct mengacu pada jumlah siklus amplifikasi (Cycle Threshold) di mana sinyal fluoresensi produk yang diperkuat mencapai ambang fluoresensi yang ditetapkan. "C" adalah singkatan dari Cycle, dan "T" adalah singkatan dari Threshold. Secara sederhana, nilai Ct adalah jumlah siklus yang diperlukan agar templat awal dalam qPCR mencapai jumlah produk tertentu, yang akan dijelaskan lebih lanjut nanti.

Apa fungsi nilai Ct?

1. Hubungan antara Amplifikasi Eksponensial, Jumlah Template, dan Nilai Ct

Dalam skenario ideal, selama qPCR, gen diperkuat secara eksponensial dan terakumulasi selama sejumlah siklus tertentu. Hubungan antara jumlah siklus amplifikasi dan jumlah produk dapat dinyatakan sebagai: jumlah produk yang diperkuat = jumlah templat awal×(1 + En)^jumlah siklus. Namun, reaksi qPCR tidak selalu terjadi dalam kondisi ideal. Ketika jumlah produk yang diperkuat mencapai "jumlah produk tertentu," jumlah siklus pada titik ini adalah nilai Ct, yang menunjukkan periode amplifikasi eksponensial. Hubungan antara nilai Ct dan jumlah templat awal adalah sebagai berikut: terdapat hubungan linier antara nilai Ct templat dan logaritma nomor salinan awal templat tersebut. Konsentrasi templat awal yang lebih tinggi menghasilkan nilai Ct yang lebih rendah, sedangkan konsentrasi templat awal yang lebih rendah menghasilkan nilai Ct yang lebih tinggi.

2.Kurva Amplifikasi, Ambang Fluoresensi, dan Kuantitas Produk Tertentu

Kuantitas produk amplifikasi qPCR secara langsung direpresentasikan dalam bentuk sinyal fluoresensi, yang dikenal sebagai kurva amplifikasi. Pada tahap awal PCR, ketika amplifikasi berada dalam kondisi ideal dan jumlah siklus rendah, akumulasi produk minimal, dan tingkat fluoresensi yang dihasilkan tidak dapat dibedakan secara signifikan dari derau fluoresensi latar belakang. Selanjutnya, produksi fluoresensi memasuki fase eksponensial. Jumlah produk PCR dapat dideteksi pada titik tertentu ketika reaksi baru saja memasuki fase eksponensial, yang disebut sebagai "kuantitas produk tertentu." Ini dapat digunakan untuk menyimpulkan konten awal templat. Oleh karena itu, intensitas sinyal fluoresensi yang sesuai dengan kuantitas produk tertentu dikenal sebagai ambang fluoresensi.

Pada tahap PCR selanjutnya, kurva amplifikasi tidak lagi menunjukkan amplifikasi eksponensial dan memasuki fase linear dan fase plateau.

3. Reproduktifitas nilai Ct

Ketika siklus PCR mencapai jumlah siklus di mana nilai Ct terjadi, siklus tersebut baru saja memasuki fase amplifikasi eksponensial yang sebenarnya. Pada titik ini, kesalahan minor belum diperkuat, sehingga reproduktifitas nilai Ct sangat baik. Ini berarti bahwa apakah templat yang sama diperkuat pada waktu yang berbeda atau dalam tabung yang berbeda pada saat yang sama, nilai Ct yang diperoleh tetap konstan.

Berapa kisaran nilai Ct?

1.Efisiensi amplifikasi En

Efisiensi amplifikasi PCR mengacu pada efisiensi di mana polimerase mengubah gen target menjadi produk amplifikasi.Efisiensi amplifikasi adalah 100% ketika satu molekul DNA diubah menjadi dua molekul DNA. Efisiensi amplifikasi umumnya dilambangkan sebagai En. Untuk memudahkan analisis dalam artikel berikutnya, berikut adalah pengantar singkat mengenai faktor-faktor yang memengaruhi efisiensi amplifikasi.

2.Kisaran nilai Ct

Kisaran nilai Ct adalah 15-35. Nilai Ct kurang dari 15 dianggap berada dalam fase dasar dan belum mencapai ambang batas fluoresensi. Idealnya, terdapat hubungan linier antara nilai Ct dan logaritma nomor salinan awal templat, yang dikenal sebagai kurva standar. Dengan menggunakan kurva standar, ketika efisiensi amplifikasi adalah 100%, nilai Ct untuk mengukur satu salinan gen dihitung menjadi sekitar 35. Jika nilai Ct lebih besar dari 35, secara teoritis, nomor salinan awal templat kurang dari 1, yang dapat dianggap tidak signifikan secara statistik.

Untuk gen yang berbeda, rentang nilai Ct, karena variasi jumlah templat awal salinan gen dan efisiensi amplifikasi, memerlukan pembuatan kurva standar untuk gen tersebut guna menghitung rentang deteksi linear gen.

3.Faktor-faktor yang mempengaruhi nilai Ct
Seperti yang ditunjukkan oleh hubungan antara jumlah siklus amplifikasi dan jumlah produk: Jumlah produk amplifikasi = Jumlah templat awal × (1 + En)^jumlah siklus, dapat dilihat bahwa dalam kondisi ideal, jumlah templat awal dan En akan memengaruhi nilai Ct. Perbedaan dalam kualitas templat atau efisiensi amplifikasi dapat menyebabkan nilai Ct menjadi terlalu tinggi atau terlalu rendah.

4. Nilai Ct terlalu tinggi atau terlalu rendah
Xiao Yi berkonsultasi dengan para ahli di departemen teknis perusahaan kami dan merangkum penyebab dan solusi untuk dua jenis masalah umum dengan nilai Ct untuk mencerahkan pembaca kami.

Demikianlah analisis tentang nilai Ct abnormal yang menjadi penyebab masalah ini. Selanjutnya, Xiao Yi akan merekomendasikan serangkaian produk hemat biaya untuk memastikan data eksperimen Anda lebih akurat dan andal. Datang dan pilih produk favorit Anda!