PCR kuantitatif fluoresensi (qPCR) merupakan teknik yang umum digunakan di laboratorium, yang dapat diterapkan pada analisis ekspresi gen, penentuan genotipe, deteksi patogen, analisis SNP, dan banyak lagi. Pengoperasian qPCR sederhana, dan prinsipnya mudah dipahami. Kini, menghadapi tumpukan data yang berantakan, cara menganalisis hasilnya menjadi tugas yang berat. Hari ini, Xiao Yi akan memandu Anda tentang cara menyederhanakan proses yang rumit dan dengan mudah memperoleh data yang dapat dipublikasikan di jurnal SCI!
Metode analisis umum yang digunakan dalam qPCR meliputi kuantifikasi relatif dan kuantifikasi absolut, dan pilihan antara metode ini harus didasarkan pada desain eksperimen yang berbeda. Dalam edisi ini, kami akan fokus pada aplikasi umum qPCR——analisis ekspresi gen, di mana metode kuantifikasi relatif umumnya dipilih.
Desain Eksperimen
Misalkan saat ini kita perlu mempelajari efek induksi cahaya pada ekspresi gen Arabidopsis AtSUC2. Kelompok kontrol akan terdiri dari tanaman Arabidopsis yang belum menjalani perawatan apa pun, sedangkan kelompok eksperimen akan terdiri dari tanaman yang telah dirawat dengan induksi cahaya tertentu. RNA akan diekstraksi dari kedua kelompok dan ditranskripsi balik untuk memperoleh cDNA, yang kemudian akan digunakan sebagai templat. Gen Arabidopsis GAPDH akan dipilih sebagai referensi internal untuk percobaan qPCR.
Sumur qPCR yang perlu disiapkan adalah sebagai berikut:
1) NTC (No Template Control) digunakan untuk memverifikasi apakah ada kontaminasi dalam sistem PCR.
2) NRT (Tanpa Transkripsi Terbalik) mengacu pada penggunaan RNA yang belum mengalami transkripsi terbalik sebagai cetakan, yang berfungsi sebagai kontrol terhadap kontaminasi gDNA.
3) Itu gen referensi internal digunakan untuk mengoreksi perbedaan yang disebabkan oleh variasi konsentrasi awal sampel.
4) Pemilihan sampel kontrol Secara umum terbagi dalam kategori berikut:
- Untuk menilai efek perawatan tertentu pada ekspresi gen, sampel yang tidak dirawat digunakan sebagai sampel referensi.
- Untuk mendeteksi perbedaan ekspresi gen pada waktu yang berbeda, sampel pada waktu 0 digunakan sebagai sampel referensi.
- Untuk membandingkan perbedaan ekspresi gen di antara jaringan yang berbeda, satu jaringan dipilih secara acak sebagai sampel referensi.
Satu hal yang perlu diperhatikan di sini adalah bahwa untuk setiap bahan yang disebutkan di atas, 3 sumur PCR (1, 2, 3) telah disiapkan. Ini adalah duplikat PCR, juga dikenal sebagai replikasi teknis, yang dimaksudkan untuk menghilangkan kesalahan operasional dan mengevaluasi efisiensi amplifikasi secara akurat. Selain itu, replikasi biologis perlu dibuat, yang melibatkan pelaksanaan percobaan yang sama pada bahan yang berbeda (waktu, pabrik, kelompok, pelat reaksi yang berbeda) untuk mengkalibrasi variabilitas biologis dan menganalisis apakah perlakuan tersebut memiliki signifikansi statistik. Secara khusus dalam kasus ini, baik kelompok eksperimen maupun kelompok kontrol memerlukan setidaknya dua set sampel Arabidopsis lagi (A, B, C) untuk diproses. RNA diekstraksi dari setiap set dan ditranskripsi balik, diikuti oleh qPCR. Untuk analisis statistik, rata-rata dari tiga replikasi biologis digunakan.
Analisis Hasil — Metode ΔΔCt
Karakteristik metode ΔΔCt ialah metode ini hanya mengandalkan nilai Ct untuk perhitungan, tetapi premisnya adalah bahwa efisiensi amplifikasi gen target dan gen referensi harus relatif konsisten dan keduanya berada dalam kisaran 90-110%.
Rumus perhitungan khususnya adalah sebagai berikut:
ΔCt = Ct (gen target) - Ct (gen referensi)
ΔΔCt = ΔCt (kelompok eksperimen) - ΔCt (kelompok kontrol)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
Dengan asumsi percobaan di atas mempelajari efek induksi cahaya pada ekspresi gen Arabidopsis AtSUC2, hasil qPCR adalah sebagai berikut:
Selama perhitungan, pertama-tama kami menghitung rata-rata data 2^-△Ct untuk kelompok kontrol (seperti yang ditunjukkan pada gambar di atas, yaitu 0,00116). Kemudian, kami membagi setiap nilai 2^-△Ct dengan rata-rata ini untuk memperoleh nilai 2^-△△Ct. Terakhir, kami mengurutkan nilai-nilai ini untuk memperoleh rata-rata dan simpangan baku, yang menunjukkan bahwa tingkat ekspresi gen target dalam kelompok eksperimen meningkat sekitar 9,73 kali lipat dibandingkan dengan kelompok kontrol.
Hasilnya diplot menggunakan perangkat lunak Graphpad sebagai berikut:
Nilai P yang dihitung menggunakan uji-t perangkat lunak adalah 0,0024, yang kurang dari 0,05, menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik dan hasilnya dapat diandalkan.
Analisis Hasil — Metode Kurva Standar Ganda
Dalam aplikasi praktis, karena efisiensi amplifikasi gen target dan gen referensi sering kali berbeda, maka perlu mendesain ulang primer dan mengoptimalkan kondisi reaksi untuk mencapai efisiensi amplifikasi yang sama. Namun, kita juga dapat memilih metode yang lebih mudah, yaitu pendekatan kurva standar ganda.
Di sini, mari kita pahami terlebih dahulu metode analisis kuantifikasi absolut. Langkah-langkah spesifiknya adalah mengamplifikasi fragmen target melalui PCR, kemudian memasukkan fragmen target ke dalam vektor kloning, mengekstrak plasmid rekombinan, dan setelah sekuensing mengonfirmasi kebenarannya, plasmid tersebut dapat digunakan sebagai standar. Jumlah DNA plasmid dapat diukur menggunakan instrumen seperti Nanodrop, dan nomor salinan diubah menjadi salinan plasmid tertentu menggunakan rumus konversi nomor salinan. Setelah itu, DNA diamplifikasi mengikuti serangkaian pengenceran. Kurva standar diplot dengan logaritma nomor salinan standar sebagai sumbu x dan nilai Ct terukur sebagai sumbu y. Berdasarkan nilai Ct dari sampel yang tidak diketahui, nomor salinan absolutnya dapat dihitung.
Rumus perhitungan nomor salinan:
Jumlah salinan = (massa ÷ massa molekul relatif) × 6,02 × 10^23
Metode kurva standar ganda melibatkan pembuatan sampel standar secara terpisah untuk gen target dan gen referensi, melakukan kuantifikasi absolut, dan membuat kurva standar. Setelah menghitung jumlah salinan absolut dari sampel yang tidak diketahui, dilakukan perbandingan, sehingga menghasilkan akurasi yang lebih tinggi.
Rumus perhitungan khususnya adalah sebagai berikut:
Q = Jumlah salinan gen target / Jumlah salinan gen referensi
RQ = Q (eksperimental) / Q (kontrol)
Dalam percobaan yang disebutkan di atas, yang menyelidiki efek induksi cahaya pada ekspresi gen AtSUC2 Arabidopsis, sampel standar untuk AtSUC2 dan GAPDH dibuat, dan kurva standar berikut disiapkan:
Nilai Ct untuk gen target dan gen referensi internal dalam sampel yang akan diuji adalah sebagai berikut:
Selama perhitungan, pertama-tama, nilai Ct dari gen target dan gen referensi internal disubstitusikan ke dalam hubungan linier kurva standar untuk memperoleh jumlah salinan absolut dari gen target dan gen referensi internal pada kelompok eksperimen dan kontrol. Kemudian, dengan menggunakan rumus Q = jumlah salinan gen target / jumlah salinan gen referensi, tingkat ekspresi gen target dinormalisasi.Akhirnya, menurut rumus RQ = Q (eksperimental) / Q (kontrol), RQ dihitung sebesar 9,71, yang menunjukkan bahwa tingkat ekspresi gen target pada kelompok eksperimen adalah 9,71 kali lebih tinggi daripada kelompok kontrol.
Hasilnya diplot menggunakan perangkat lunak GraphPad sebagai berikut:
Nilai P yang dihitung menggunakan uji-t perangkat lunak adalah 0,0008, yang kurang dari 0,05, menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik dan hasilnya dapat diandalkan.
Itulah kesimpulan analisis data qPCR untuk sesi ini. Selanjutnya, saya akan merekomendasikan serangkaian produk hemat biaya untuk memastikan data eksperimen Anda lebih akurat dan andal. Datang dan ambil produk-produk tersebut!
| Nama Produk | Kucing# | Ukuran |
| Campuran Master Hieff UNICON™ Universal Biru qPCR SYBR Hijau | 11184ES08 | 5×1ml |
| Hifair™ Ⅲ Sintesis cDNA Untai Pertama SuperMix untuk qPCR (pencerna gDNA plus) | 11141ES60 | 100 ribu |
| Hifair™ AdvanceFast Pencernaan RT-gDNA Satu Langkah SuperMix untuk qPCR | 11151ES60 | 100 ribu |
| Kit Sintesis cDNA Hifair™ AdvanceFast 1st Strand (Tanpa Pewarna) | 11150ES60 | 100 ribu |