Panjang miRNA dewasa hanya sekitar 20 nt, biasanya, primer maju akan menutupi seluruh panjangnya atau bahkan memiliki bagian yang berlebih, dan primer mundur tidak akan memiliki tempat untuk ditempatkan. Solusi pasar saat ini adalah menambah panjang transkrip mundur selama transkripsi mundur. Metode umum meliputi metode tailing dan metode stem-loop.

1. Pendahuluan
2. Produk yang Direkomendasikan
3. Daftar produk terkait

1. Pendahuluan

MikroRNA (miRNA) adalah RNA kecil beruntai tunggal dengan ukuran sekitar 21-23 basa, yang dihasilkan dari prekursor RNA beruntai tunggal dengan struktur jepit rambut sekitar 70-90 basa setelah diproses oleh enzim Dicer. miRNA terutama mengikat secara spesifik ke daerah non-coding ujung 3' mRNA gen target, dan mengatur proses translasi mRNA gen target pasca-transkripsi, sehingga menghalangi translasi mRNA dan mendorong degradasi mRNA, yang mengakibatkan penurunan ekspresi protein. Peran miRNA terlibat dalam terjadinya dan perkembangan berbagai penyakit kardiovaskular seperti ontogeni, diferensiasi jaringan, proliferasi sel, dan apoptosis.

Gambar 1. Diagram skema sintesis miRNA in vivo

Panjang miRNA dewasa hanya sekitar 20 nt, biasanya, primer maju akan menutupi seluruh panjangnya atau bahkan memiliki bagian yang berlebih, dan primer mundur tidak akan memiliki tempat untuk ditempatkan. Solusi pasar saat ini adalah menambah panjang transkrip mundur selama transkripsi mundur. Metode umum meliputi metode tailing dan metode stem-loop.

Gambar 2. Sintesis miRNA dengan metode tailing

Gambar 3. Sintesis miRNA dengan metode stem-loop

Metode tailing menggunakan PolyA polimerase untuk menambahkan ekor Poly(A) ke miRNA yang sudah matang dan menggunakan Oligo-dT dengan urutan universal sebagai primer transkripsi balik untuk mensintesis miRNA yang diperpanjang yang sesuai dengan untai pertama cDNA. Metode stem-loop menggunakan urutan universal yang dilipat ke dalam struktur stem-loop sebagai primer untuk mensintesis untai pertama cDNA yang sesuai dengan miRNA yang diperpanjang. Struktur stem-loop akan dibuka pada suhu yang sesuai selama proses amplifikasi berikutnya. dan dikombinasikan dengan primer amplifikasi yang relevan.

Tabel 1.Perbandingan Tailing dan Stem-loop

2. Produk yang Direkomendasikan

2.1 Yeasen Kombinasi kuantitatif inversi ekor miRNA (11148ES&11171ES)

Gambar 4. Kit Sintesis cDNA miRNA untai pertama 11148ES-Hifair™

Kit ini mengadopsi metode tailing untuk membalikkan transkripsi cDNA untai pertama miRNA. Buffer RT miRNA 2×Hifair™ dalam produk ini mengandung semua bahan baku dan primer untuk reaksi tailing miRNA dan reaksi transkripsi balik, dan telah dioptimalkan dengan saksama. Kit ini dapat memastikan bahwa proses modifikasi poli(A) dan transkripsi balik ujung 3' miRNA dilakukan secara efisien secara bersamaan.

Gambar 5. 11171ES -Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

Generasi baru reagen deteksi PCR kuantitatif fluoresensi campuran yang dikembangkan khusus untuk deteksi kuantitatif miRNA, mengandung Pewarna Referensi Pasif ROX khusus, cocok untuk semua instrumen qPCR, tidak perlu menyesuaikan konsentrasi ROX pada instrumen yang berbeda, cukup dalam reaksi persiapan Amplifikasi dapat dilakukan dengan menambahkan primer dan templat ke sistem. DNA polimerase mengadopsi polimerase hot-start yang dimodifikasi secara kimia, dan bekerja sama dengan sistem Buffer khusus, yang membuat spesifisitas dan sensitivitas reaksi lebih tinggi, dan dapat mengukur secara akurat dalam rentang yang lebih luas.

2.2 Kinerja produk

2.2.1 Kompatibel dengan instrumen qPCR semua platform

Gambar 6. Hasil yang kompatibel dengan instrumen qPCR yang berbeda

Menggunakan Total RNA sel 293T sebagai cetakan, transkripsi balik dilakukan dengan Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES).cDNA yang diperoleh diencerkan 10 kali lipat, dan kemudian menggunakan Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) untuk mendeteksi gen referensi internal hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p, dan U6, masing-masing.

2.2.2 Tingkat deteksi tinggi, hingga 10 pg

Gambar 7. Plot amplifikasi

Gambar 8. Plot amplifikasi

Bahasa Indonesia: Menggunakan hsa-miR-let-7e-5p(a) sintetis dan Total RNA(b) sel 293T sebagai templat, diencerkan menjadi gradien berikut, berturut-turut: 60 salinan menjadi 606 salinan (6 gradien) dan 10 pg-100 ng (5 gradien), ditranskripsi balik dengan Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES), dan cDNA yang dihasilkan dideteksi dengan Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) untuk ekspresi gen hsa-miR-let-7e -5p.

2.2.3 Spesifisitas tinggi, mampu membedakan perbedaan basa tunggal antara miRNA dalam keluarga yang sama

Gambar 9. Bedakan perbedaan basa tunggal antara miRNA

Famili hsa-let-7 manusia memiliki beberapa miRNA, dengan beberapa basa yang berbeda satu sama lain, atau bahkan hanya memiliki satu perbedaan basa. MiRNA sintetis untuk setiap isoform Let-7 (hsa-miR-let-7a~Let-7i, has-miR-98) ditranskripsi balik menjadi cDNA menggunakan Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES), menggunakan Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) untuk mengamplifikasi miRNA ini secara terpisah dengan primer yang berbeda, dan menghitung tingkat kecocokan menggunakan Persamaan 2-ΔCT x 100%. Hasilnya menunjukkan bahwa anggota famili subtipe yang berkerabat dekat dapat dibedakan secara efektif.

2.2.4 Efisiensi amplifikasi yang sangat baik

Gambar 10. Efisiensi amplifikasi

Gambar 11. Efisiensi amplifikasi

Gen miR-let-7b-5p, miR-let-7c-5p, miR-let-7e-5p, miR-let-7f-5p diamplifikasi menggunakan sel 293T manusia dan Total RNA hati tikus sebagai templat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dibandingkan dengan produk sejenis, Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) cocok dengan sistem reaksi Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) dengan kinerja yang sangat baik.

2.2.5 Stabilitas yang sangat baik

Gambar 12. Analisis stabilitas produk pada suhu 37℃ selama 7 hari

Gambar 13. Analisis hasil setelah 50 siklus beku-cair

Gambar 14. Sifat analitik stabil dari sistem reaksi kuantitatif pada suhu yang berbeda selama 24 jam

Transkripsi balik dilakukan dengan Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) menggunakan Total RNA sel 293T sebagai cetakan, dan cDNA yang diperoleh diencerkan 10 kali lipat dan dideteksi dengan Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES). Ekspresi hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p, hsa-miR-let-7e-5p. △Ct<0,5.

2.3 Yeasen Kombinasi kuantitatif inversi stem-loop miRNA (11139ES&11170ES)

Gambar 15. 11139ES-Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (pengolah gDNA plus)

Kit ini dikembangkan berdasarkan Hifair™ III Reverse Transcriptase.Kecepatan sintesis cDNA enzim ini cepat, dan stabilitas termalnya sangat ditingkatkan. Pada saat yang sama, enzim ini meningkatkan afinitas dengan templat dan cocok untuk transkripsi balik sejumlah kecil templat dan gen dengan salinan rendah. Kemampuan Hifair™ III Reverse Transcriptase untuk mensintesis cDNA dengan panjang penuh juga telah ditingkatkan, memungkinkan sintesis cDNA hingga 19,8 kb.

Gambar 16. 11170ES-Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

Produk ini merupakan campuran utama khusus untuk kuantifikasi miRNA menggunakan metode fluoresensi chimeric SYBR Green I. Karena urutan miRNA pendek dan urutan miRNA dalam keluarga yang sama sering kali sangat mirip, spesifisitas sangat dibutuhkan selama kuantifikasi. Produk ini berbasis DNA polimerase hot-start, dengan Buffer yang dioptimalkan, yang dapat sangat mengurangi amplifikasi non-spesifik; pada saat yang sama, Pewarna Referensi ROX khusus membuat campuran utama cocok untuk semua instrumen qPCR, dan tidak perlu menyesuaikan ROX pada instrumen yang berbeda. Amplifikasi dapat dilakukan dengan menambahkan primer dan templat saat menyiapkan sistem reaksi.

2.3.1 Kompatibel dengan instrumen qPCR semua platform

Gambar 17. Hasil yang kompatibel dengan instrumen qPCR yang berbeda

Menggunakan total RNA sel hati tikus sebagai cetakan, transkripsi balik dilakukan dengan Hifair™ III 1st Strand
Kit Sintesis cDNA (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES), dan cDNA yang diperoleh diencerkan 40 kali lipat dan digunakan Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) untuk mengamplifikasi gen mmu-miR-125a manusia.

2.3.2 Sensitivitas tinggi, hingga 10 pg

Gambar 18. Deteksi sensitivitas

Dengan menggunakan total RNA dari sel hati tikus sebagai cetakan, transkripsi balik dilakukan dengan Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES), dan cDNA yang diperoleh diencerkan secara serial 10 kali lipat (kisaran 10pg/μL). -0,1 μg/μL), mengamplifikasi gen mmu-miR-125a, mmu-miR-132, dan mmu-miR-351 asal murine.

2.3.3 Spesifisitas tinggi, mampu membedakan perbedaan basa tunggal antara miRNA dalam keluarga yang sama

Gambar 19. Bedakan perbedaan basa tunggal antara miRNA

Keluarga hsa-let-7 manusia memiliki beberapa miRNA, dengan beberapa basa yang berbeda satu sama lain, atau bahkan hanya memiliki satu perbedaan basa. MiRNA ini diperkuat secara terpisah dengan primer yang berbeda menggunakan Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES), dan tingkat kecocokan dihitung menggunakan rumus 2^-Δct x 100%.

2.3.4 Pengulangan yang baik

Gambar 20. Deteksi pengulangan

Menggunakan Total RNA dari sel 293T manusia sebagai cetakan untuk transkripsi balik, transkripsi balik dilakukan dengan Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES), dan cDNA yang diperoleh diencerkan hingga 50 kali lipat dan digunakan Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) yang digunakan untuk mengamplifikasi gen hsa-let-7a manusia dalam percobaan replikasi 90 sumur.

2.3.5 Stabilitas yang baik

Gambar 21.Analisis stabilitas 11170ES pada suhu berbeda selama 14 hari

Gambar 22. Analisis pembekuan dan pencairan berulang 11170ES

Gambar 23. Sifat analisis stabil sistem reaksi kuantitatif pada suhu berbeda selama 24 jam

Total RNA dari sel hati tikus digunakan sebagai cetakan untuk transkripsi balik dengan Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES). cDNA yang diperoleh diencerkan 100 kali lipat untuk mengamplifikasi gen mmu-miR-132 murine.

3. Daftar produk terkait

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., didirikan pada tahun 2014, merupakan perusahaan teknologi tinggi yang bergerak di bidang R&D dan produksi bahan baku enzim alat dan antibodi antigen. Produknya meliputi enzim diagnostik molekuler, protein, dan antibodi yang digunakan dalam farmasi, pengujian keamanan pangan, pembiakan, peradilan, dan industri lainnya. Kami berkomitmen untuk menyediakan produk dan layanan berkualitas tinggi kepada pelanggan di bidang ilmu hayati. Produk terkait yang disediakan oleh Yeasen adalah sebagai berikut:

Tabel 2. Daftar produk terkait