PCR langsung adalah reaksi yang secara langsung menggunakan darah, jaringan hewan atau tumbuhan, dll., untuk amplifikasi tanpa langkah-langkah ekstraksi asam nukleat dan pemurnian asam nukleat. PCR langsung memberikan kemudahan yang belum pernah ada sebelumnya untuk amplifikasi DNA, yang dapat menghemat banyak waktu. Jadi, apa saja reagen dan produk yang digunakan dalam PCR langsung?

1. Apa itu PCR langsung?
2. Reagen apa saja yang dibutuhkan untuk PCR langsung?
3. Skenario aplikasi dan karakteristik Direct PCR Kit
4. Data Produk
5. Umpan Balik Klien
6. Informasi Pemesanan Produk

1. Apa itu PCR langsung?

Setelah terus-menerus disempurnakan dan disempurnakan oleh banyak ilmuwan di seluruh dunia, teknologi PCR telah menjadi metode penelitian dasar yang paling banyak digunakan, paling sering digunakan, dan paling penting di seluruh bidang ilmu hayati. Touch Down PCR, RT-PCR, Real-Time PCR, Multi PCR, dll. yang dikembangkan berdasarkan penerapan luas teknologi PCR tradisional, serta PCR Digital (PCR Digital) terkini, telah sangat memperkaya penelitian sebagian besar peneliti ilmiah. Metode-metode ini telah sangat mempercepat perkembangan ilmu hayati modern, khususnya biologi molekuler, dan memberikan kontribusi besar bagi penelitian kehidupan dan alam bagi seluruh umat manusia. Teknologi PCR tradisional dan berbagai teknologi baru serta aplikasi baru yang berasal darinya memiliki prasyarat, yaitu, templat asam nukleat dengan kemurnian tinggi perlu diperoleh terlebih dahulu. Setiap sampel biologis perlu melalui serangkaian pemrosesan sampel yang rumit dan membosankan untuk memperoleh sampel asam nukleat yang memenuhi persyaratan teknis PCR. Pemisahan dan ekstraksi DNA dan RNA selalu menjadi pekerjaan dasar yang perlu diulang-ulang oleh personel ilmiah dan teknis terkait setiap hari. Karena perbedaan yang sangat besar antara sampel, proses pemisahan dan ekstraksi DNA dan RNA juga sangat berbeda. Pekerjaan ini membutuhkan tingkat kemahiran teknis yang tinggi bagi operator. Karena penggunaan beberapa reagen kimia yang sangat beracun dalam teknologi pemisahan dan ekstraksi tradisional, paparan jangka panjang akan menyebabkan kerusakan yang tidak dapat dipulihkan pada tubuh operator, dan bahkan menyebabkan kerusakan langsung selama percobaan. Reagen kimia seperti fenol dan kloroform merupakan karsinogen penting di laboratorium, dan nitrogen cair yang digunakan dalam proses pemisahan asam nukleat dan ekstraksi jaringan tanaman menimbulkan ancaman yang lebih besar terhadap keselamatan operator selama percobaan karena suhunya yang sangat rendah. Pada saat yang sama, bagi mereka yang memiliki sejumlah besar sampel untuk dipelajari, memisahkan dan mengekstraksi asam nukleat merupakan tugas yang padat karya. Sekarang kit isolasi dan ekstraksi asam nukleat di pasaran sudah matang dan ada banyak merek, tetapi semuanya kurang lebih sama. Baik itu kit sentrifugal kolom membran silika atau kit metode manik magnetik, banyak waktu yang dibutuhkan dan biayanya tinggi. Selain biaya kit, ada persyaratan khusus untuk peralatan laboratorium. Stasiun kerja otomatis yang digunakan dalam metode manik magnetik adalah peralatan bernilai tinggi berskala besar yang sangat umum, yang merupakan pengeluaran besar bagi laboratorium. Singkatnya, sebelum melakukan eksperimen PCR, praperlakuan sampel merupakan masalah yang tidak dapat dihindari dan terus-menerus menyulitkan para peneliti. Bagaimana cara mengatasi masalah ini dan langsung melakukan eksperimen PCR tanpa pemisahan dan ekstraksi asam nukleat selalu menjadi masalah yang dipikirkan oleh banyak peneliti ilmiah dan personel laboratorium klinis.

PCR langsung adalah reaksi di mana jaringan hewan atau tumbuhan digunakan secara langsung untuk amplifikasi tanpa ekstraksi asam nukleat. Dalam banyak hal, PCR langsung bekerja seperti PCR konvensional.Perbedaan utamanya adalah buffer khusus yang digunakan dalam PCR langsung. Sampel dapat langsung dikenakan reaksi PCR tanpa ekstraksi asam nukleat, tetapi ada persyaratan yang sesuai untuk toleransi enzim yang terlibat dalam reaksi PCR langsung dan kompatibilitas buffer. Meskipun ada lebih banyak atau lebih sedikit inhibitor PCR dalam sampel umum, PCR langsung masih dapat mencapai amplifikasi yang andal di bawah aksi enzim dan buffer. Namun, reaksi PCR tradisional perlu menggunakan asam nukleat berkualitas tinggi sebagai templat untuk reaksi tersebut. Jika templat tersebut mengandung protein dan pengotor lainnya, hal itu akan menghambat kelancaran reaksi PCR.

Bidang aplikasi PCR langsung yang paling awal adalah bidang hewan dan tumbuhan, seperti darah, jaringan, dan rambut tikus, kucing, ayam, kelinci, domba, sapi, dan hewan lainnya; daun dan biji tanaman, dll. PCR langsung digunakan untuk mempelajari genotipe, transgenik, deteksi plasmid, analisis knockout gen, identifikasi sumber DNA, identifikasi spesies, analisis SNP, dan bidang lainnya. Bidang-bidang ini memiliki beberapa karakteristik umum, yaitu, kandungan gen target relatif tinggi, dan ekstraksi asam nukleat merepotkan. Oleh karena itu, PCR langsung tidak hanya dapat menghemat waktu dan berdampak kecil pada hasil, tetapi juga menghemat biaya.

2. Reagen apa saja yang dibutuhkan untuk PCR langsung?

2.1 Sampel lisat

Lisat sampel dapat disiapkan sendiri atau dibeli. Perbedaan komponen pada berbagai merek lisat akan menyebabkan kemampuan lisisnya berbeda, dan kemudian waktu lisisnya akan sedikit berbeda. Misalnya, untuk persiapan sampel jaringan hewan, umumnya direkomendasikan untuk melisiskannya selama 30 menit atau semalaman, dan lisat untuk virus berkisar antara 3-10 menit.

2.2 Campuran induk PCR

Disarankan untuk menggunakan DNA polimerase hot-start untuk meningkatkan amplifikasi spesifik dan kemampuan amplifikasi yang lebih kuat. Inti dari PCR langsung adalah polimerase yang sangat tahan.

2.3 Menghilangkan atau menghambat komponen dalam sampel yang mempengaruhi amplifikasi DNA

Setelah sampel diproses oleh lisat, protein, lipid, dan serpihan sel lainnya akan dilepaskan, dan zat-zat ini akan menghambat reaksi PCR. Oleh karena itu, PCR langsung perlu menambahkan penghilangan atau penghambat yang sesuai untuk mengurangi pengaruh faktor-faktor ini.

3. Skenario aplikasi dan karakteristik Direct PCR Kit

Kit PCR Langsung dari Yeasen dapat langsung memperbanyak sampel tanaman, jaringan hewan atau darah, dan sampel asli lainnya tanpa pemurnian asam nukleat, yang sangat menyederhanakan proses eksperimen PCR. Genotyping berbasis PCR (Gambar 1) dilakukan dengan menggunakan sampel asli tanpa pemurnian genom (Gambar 1A) atau menggunakan lisatnya (Gambar 1B) sebagai templat. Dibandingkan dengan Genotyping berbasis PCR umum, kit PCR langsung memiliki konsumsi sampel yang lebih sedikit, pengoperasian yang sederhana, biaya eksperimen yang rendah, dan deteksi sampel kuantitatif berkualitas tinggi.

Gambar 1. Teknologi PCR langsung.

A. Metode langsung: Ambil sejumlah kecil sampel dan langsung tambahkan ke dalam campuran PCR untuk identifikasi PCR. B. Metode lisis: Tambahkan sampel ke dalam larutan lisis untuk melepaskan genom, dan tambahkan sejumlah kecil cairan supernatan lisis ke dalam campuran PCR untuk identifikasi PCR.

3.1 Aplikasi

Deteksi amplifikasi gen hewan, genotipe hewan transgenik, identifikasi tanaman transgenik, genotipe tanaman, dll.

3.2 Fitur

★   Langsung: tidak ada pemurnian DNA;
★   Cepat: 10 menit untuk menyelesaikan persiapan templat, 50 menit untuk menyelesaikan reaksi PCR;
★   Sederhananya: Sampel dapat dilisiskan tanpa pemotongan atau penggilingan;
PCR Mix berbentuk master mix, yang mengurangi langkah penambahan sampel
★   Hemat: konsumsi material lebih sedikit
★   Throughput tinggi: reaksi lisis dapat diselesaikan dalam pelat 96 sumur
★   Toleransi inhibitor yang kuat

4. Data Produk

4.1 Tipe universal multi-hewan: Kit PCR Langsung Jaringan Hewan

4.1.1 Tercepat: mempersingkat waktu operasi

Gambar 2. Kit PCR langsung jaringan hewan dari Yeasen dapat menghemat lebih banyak waktu.

4.1.2 Contoh: Identifikasi Genotipe Tikus Knockout

Gambar 3. Hasil amplifikasi langsung jaringan hewan menggunakan kit PCR langsung untuk mendeteksi hewan yang mengalami knockout gen.

M: 100bp DNA ladder. Jalur 1-8: lisat sebagai cetakan. +: 50 ng DNA genomik murni sebagai cetakan. ﹣: Air deionisasi sebagai cetakan. Beberapa siklus: 35 siklus. Fragmen tunggal (580bp): Genom homozigot hewan knockout. Fragmen tunggal (180bp): Genom tipe liar. Dua fragmen (580bp/180bp): Genom heterozigot hewan knockout.

4.2 Spesifik Hewan Pengerat: Kit PCR Langsung Jaringan Tikus

4.2.1 Lebih cepat: Pelepasan gen yang cukup

Gambar 4 Hasil amplifikasi langsung kit PCR langsung jaringan tikus dengan waktu lisis yang berbeda.

M: 100bp DNA ladder. +: 50 ng DNA genomik murni sebagai cetakan. Beberapa siklus: 35 siklus.

4.2.2 Lebih baik daripada metode lisis alkali umum

Gambar 5. Hasil amplifikasi gen SOX21 pada ekor tikus yang diberi metode lisis berbeda.

M: 100 bp DNA ladder. Jalur 1-2: Lisat sebagai cetakan dengan lisis alkali umum. Jalur 3-4: Lisat sebagai cetakan dengan kit PCR langsung jaringan tikus. +: 50 ng DNA genomik murni sebagai cetakan. -: Air deionisasi sebagai cetakan. Beberapa siklus: 35 siklus.

4.2.3 Bandingkan dengan produk sejenis

Gambar 6. Hasil amplifikasi gen SOX21 pada ekor tikus yang diberi produk serupa dari merek berbeda.

M: 100 bp DNA ladder. +: 50 ng DNA genomik murni sebagai cetakan. Beberapa siklus: 35 siklus.

4.3 Kit PCR Langsung Jaringan Tanaman

4.3.1 Verifikasi sampel tanaman multi-jenis

Gambar 7. Hasil amplifikasi langsung daun dari berbagai tanaman.

M: 100 bp DNA ladder. C: DNA genomik murni sebagai cetakan.Jalur 1-2: Jaringan daun mengalami lisat sebagai pola. Beberapa siklus: 30 siklus.

5. Umpan Balik Klien

5.1 Genotipe Tikus

Gambar 8. Hasil identifikasi genotipe tikus menggunakan kit PCR langsung jaringan tikus oleh pengguna dari Beijing Jishi Life Technology Co., Ltd.

5.2 PCR Langsung Beras

Gambar 9. Amplifikasi gen terkait padi menggunakan kit PCR langsung jaringan tanaman oleh pengguna Universitas Pertanian Huazhong.

6. Informasi Pemesanan Produk

Yeasen adalah perusahaan bioteknologi yang bergerak dalam penelitian, pengembangan, produksi, dan penjualan tiga reagen biologis utama: molekul, protein, dan sel. Produk yang disediakan oleh Yeasen adalah sebagai berikut.

Tabel 1. Informasi Pemesanan Produk