Pencapaian Terobosan dari Yeasen dan bioteknologi Molefuture

Dengan pesatnya perkembangan bioteknologi, terapi mRNA, sebagai metode pengobatan yang baru muncul, telah menarik banyak perhatian karena kemampuan pemrogramannya yang kuat dan kecepatan responsnya yang cepat. Dalam bidang seperti vaksin mRNA dan terapi gen, sintesis mRNA berkualitas tinggi yang efisien merupakan langkah penting dalam mencapai tujuan terapeutik. Dalam proses ini, RNA polimerase T7 memainkan peran penting, karena dapat secara efisien mengkatalisis sintesis mRNA secara in vitro.

Masalah produk sampingan dsRNA dari RNA polimerase T7

Meskipun RNA polimerase T7 berperan penting dalam sintesis mRNA, operasi sebenarnya sering kali menghasilkan produksi RNA untai ganda (dsRNA) sebagai produk sampingan. Keberadaan dsRNA tidak hanya mengurangi hasil dan kemurnian mRNA, tetapi juga dapat memicu respons imun nonspesifik, yang memengaruhi kemanjuran dan keamanan. Oleh karena itu, pengurangan produksi dsRNA telah menjadi kebutuhan mendesak dalam industri. Saat ini, metode untuk mengurangi dsRNA terutama mencakup pengoptimalan kondisi reaksi dan penggunaan enzim tambahan. Meskipun metode ini dapat mengurangi produksi dsRNA sampai batas tertentu, metode ini sering kali disertai masalah seperti operasi yang rumit dan peningkatan biaya.

Mengapa kita harus melakukan rekayasa RNA polimerase T7?

Memodifikasi langsung RNA polimerase T7 untuk mengurangi produksi dsRNA merupakan solusi yang lebih mendasar. Teknik evolusi yang diarahkan oleh enzim dapat meningkatkan sifat katalitiknya dan meningkatkan kemurnian serta hasil produk dengan mengubah urutan atau struktur asam amino enzim secara tepat. Untuk RNA polimerase T7, modifikasi yang ditargetkan tidak hanya dapat mengurangi produksi dsRNA tetapi juga meningkatkan efisiensi dan kualitas sintesis mRNA secara keseluruhan.

Sebagai pemasok bahan baku sintesis mRNA in vitro, Yeasen Bioteknologi, dan anak perusahaannya Molefuture Bioteknologi, memiliki mengembangkan polimerase RNA T7 baru—memanfaatkan platform evolusi terarah ZymeEditor. Untuk meminimalkan produksi produk sampingan seperti dsRNA selama proses transkripsi in vitro, tim evolusi telah merekayasa polimerase RNA T7 melalui kombinasi desain rasional dan penyaringan terarah.

Bagaimana dsRNA terbentuk?

Menurut laporan literatur, produksi produk sampingan dsRNA terutama berasal dari dua sumber (Gambar 1): Yang pertama adalah selama transisi RNA polimerase T7 dari konformasi inisiasi ke konformasi elongasi pada tahap awal transkripsi, kompleks terner transkripsi rentan terhadap disosiasi [1], yang mengakibatkan pelepasan sejumlah besar rantai RNA pendek (RNA Abortif) dengan panjang sekitar 20 nt ke dalam sistem. Rantai RNA ini bertindak sebagai "primer," pasangan komplementer dengan rantai RNA panjang, dan memanjang untuk menghasilkan dsRNA di bawah aksi aktivitas RNA polimerase T7 RNA yang bergantung pada RNA (aktivitas RDRP) [2,3]. Sumber kedua dipicu oleh aktivitas transfer ribonukleotida terminal yang dimiliki oleh RNA polimerase T7. Ketika reaksi transkripsi mencapai ujung templat linier, RNA polimerase T7 dapat secara acak menambahkan beberapa ribonukleotida tanpa ketergantungan templat. Ribonukleotida ini, yang membentuk "primer acak," dapat melipat balik dan berpasangan secara komplementer dengan daerah mRNA target, meluas untuk menghasilkan dsRNA. DsRNA yang dihasilkan melalui perulangan disebut loopback dsRNA [3,4]. Oleh karena itu, untuk mengurangi produk sampingan dsRNA, fokus modifikasi RNA polimerase T7 terletak pada stabilisasi kompleks terner transkripsi awal atau pelemahan aktivitas transfer terminal dan RNA dependen RNA Polimerase (RDRP). aktivitas RNA polimerase T7.

Gambar 1. Diagram skema penghalang energi dan prinsip pembentukan dsRNA (data tidak dipublikasikan)

Cara mengatasi hambatan energi dari RNA polimerase T7 transisi konformasi....

Melalui analisis struktur dan energi bebas, tim, di satu sisi, menemukan bahwa seiring dengan perubahan konformasi RNA polimerase T7, ada juga perubahan energi. Energi bebas konformasi pemanjangan secara signifikan lebih tinggi daripada konformasi inisiasi, yang menunjukkan bahwa proses transkripsi perlu mengatasi hambatan energi yang lebih tinggi untuk menghasilkan rantai mRNA yang lengkap. Hambatan energi yang tinggi tidak menguntungkan untuk transisi konformasi yang lancar. Oleh karena itu, tim memanfaatkan rasional metode penyaringan untuk mengidentifikasi lebih dari 20 asam amino hotspot dan membangun perpustakaan mutagenesis saturasi yang sesuai.

Cara memodifikasi transfer terminal dan aktivitas RDRP dari RNA polimerase T7

Di sisi lain, dengan mempertimbangkan laporan terbatas tentang fungsi, situs, dan domain struktural yang terkait dengan transfer terminal dan aktivitas RDRP dari RNA polimerase T7, dan karena kedua aktivitas ini, yang secara fungsional serupa, kemungkinan berbagi situs utama dengan reaksi utama RNA polimerase T7—aktivitas transkripsi (yaitu, aktivitas polimerisasi RNA yang bergantung pada DNA, DDRP)—sulit untuk menemukan asam amino hotspot untuk modifikasi yang diarahkan pada situs. Oleh karena itu, tim secara bersamaan membangun beberapa pustaka mutasi acak berdasarkan PCR yang rawan kesalahan, dikombinasikan dengan kapasitas evolusi throughput tinggi dari platform ZymeEditor, yang menghasilkan keragaman yang melebihi 10^6 untuk setiap pustaka individual.

Penemuan berbasis penyelidikan ideal RNA polimerase T7

Untuk menyeimbangkan produksi RNA polimerase T7 dan memantau kandungan dsRNA dalam reaksi transkripsi in vitro, tim, dengan mengacu pada templat transkripsi yang dioptimalkan, dengan hati-hati merancang beberapa Fluoresens probe menargetkan berbagai daerah dari produk mRNA target. Probe ini mengaitkan informasi seperti hasil reaksi, integritas, dan kandungan dsRNA dalam sistem dengan sinyal fluoresensi. Semakin kuat intensitas fluoresensi sistem, semakin menguntungkan kinerja mutan. Secara teori, metode penyaringan ini dapat memberi peringkat mutan berdasarkan intensitas fluoresensi probe yang berbeda, memperoleh mutan RNA polimerase T7 dengan hasil tinggi atau RNA Abortif yang berkurang, serta mutan dengan integritas yang ditingkatkan atau dsRNA loopback yang berkurang. Ketika templat reaksi diganti dengan RNA, mutan dengan aktivitas RDRP yang berkurang juga dapat disaring secara negatif, meningkatkan selektivitas templat RNA polimerase T7. Selain itu, dengan menambahkan nukleotida yang dimodifikasi, analog kap, dan meningkatkan suhu reaksi dalam sistem reaksi tetesan, penyaringan lebih lanjut dapat dilakukan untuk memilih mutan RNA polimerase T7 yang mentoleransi substrat non-alami dan menunjukkan stabilitas termal yang lebih baik.

Cara terbaik untuk menyaring RNA polimerase T7....

Berdasarkan ukuran perpustakaan, tim mengembangkan proses penyaringan berthroughput sangat tinggi berdasarkan penyortiran tetesan teraktivasi fluoresensi (FADS) dan proses penyaringan berthroughput tinggi berdasarkan metode mikroplat tradisional (MTPS).Melalui beberapa putaran percobaan, lebih dari 10^7 mutan disaring secara total, menghasilkan beberapa mutan dengan kandungan dsRNA yang berkurang secara signifikan. Di antara mereka, beberapa mutan menunjukkan penurunan dsRNA yang disebabkan oleh RNA Abortif dalam reaksi, yang menunjukkan bahwa konformasi pemanjangan mutan polimerase ini lebih stabil. Beberapa mutan menunjukkan penurunan kandungan dsRNA loopback dalam reaksi, yang menunjukkan melemahnya aktivitas transfer terminal atau aktivitas RDRP pada mutan ini.

Mengingat keunggulan kinerja mutan yang disebutkan di atas berasal dari mekanisme yang berbeda, tim telah membangun perpustakaan pengocokan DNA yang menargetkan mereka. Setelah penyaringan, tim akhirnya memperoleh mutan dengan kinerja unggul dengan generasi dsRNA yang sangat rendah tanpa mempengaruhi hasil dan integritas mRNA (Gambar 2). Namun, hasil mutan G47A+884G yang ditemukan oleh Moderna dipengaruhi^[5] (tidak diterbitkan)

Gambar 2. Proses evolusi enzim dan karakterisasi kinerja mutan

(belum dipublikasikan)

Analisis generasi dsRNA dengan RNA polimerase T7 varian?

Setelah dilakukan analisis kuantitatif, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, menggunakan templat transkripsi 9 kb dalam kondisi pembatasan ko-transkripsi, RNA polimerase T7 tipe liar menghasilkan sekitar 2,9 ng/μg dsRNA saat menggunakan nukleotida alami, sedangkan polimerase komersial menghasilkan sekitar 2,9 ng/μg dsRNA saat menggunakan nukleotida alami. enzim T7 menghasilkan sekitar 0,18 ng/μg dsRNA. Namun, produksi dsRNA dari setiap varian RNA polimerase T7 yang dibangun kurang dari 0,10 ng/μg. Khususnya, satu variasi hanya 0,015 ng/μg, hampir 200 kali lebih rendah dibandingkan tipe liar dan 12 kali lebih rendah dibandingkan tipe komersial. produk. Setelah pengujian berulang, keunggulan kinerja varian dalam mengurangi dsRNA secara konsisten diamati dalam kondisi reaksi yang berbeda, menunjukkan kompatibilitas sistem yang baik dari mutan ini dan meletakkan dasar untuk pengurangan produksi dsRNA lebih lanjut melalui buffer reaksi. Selain itu, penyaringan FADS juga memperoleh beberapa varian dengan integritas produk dan stabilitas termal yang lebih baik, yang dapat memenuhi persyaratan aplikasi transkripsi in vitro yang lebih luas.

Gambar 3. Evaluasi generasi dsRNA oleh varian RNA polimerase T7 yang dinilai menggunakan Yeasen Kit ELISA RNA untai ganda (dsRNA) dan analisis titik blot antibodi J2.

Saat ini, beberapa mitra telah mencoba varian RNA polimerase T7 dan kami telah menerima pujian tinggi dari mereka. Penggunaan enzim baru menyederhanakan proses pemurnian mRNA, meningkatkan efisiensi kerja, dan menunjukkan kinerja luar biasa dalam berbagai skenario aplikasi.

Varian ini ada dalam aplikasi paten dan kami menyambut baik diskusi untuk kerja sama teknologi dan lisensi.

Tentang Molefuture Biotechnology

Molefuture Biotechnology adalah anak perusahaan dari Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., yang mengkhususkan diri dalam menyediakan solusi modifikasi enzim khusus yang didorong oleh teknologi evolusi enzim.Memanfaatkan sumber daya Yeasen Bioteknologi, Molefuture beroperasi pada enam platform teknologi utama: platform evolusi enzim inovatif ZymeEditor, platform ekspresi efisiensi tinggi multi-host, platform pengembangan proses fermentasi, platform pengembangan proses pemurnian, platform produksi enzim ultra-bersih, dan platform analisis enzim serta kendali mutu. Dengan enam platform teknologi ini, Molefuture dapat menawarkan serangkaian solusi khusus yang lengkap termasuk evolusi yang diarahkan pada enzim, pengembangan enzim baru, pengembangan proses enzim, dan produksi skala-atas tingkat GMP untuk memenuhi permintaan aplikasi enzim di berbagai bidang seperti diagnostik in vitro, biomedis, biologi sintetis, estetika medis, zat antara farmasi, dan lain-lain.

Informasi Pemesanan

Berikut ini adalah produk representatif yang ditawarkan oleh Yeasen. Ukuran tambahan tersedia. Produk kami sangat dioptimalkan untuk bekerja sama, guna membantu memastikan kinerja dan reproduktifitas yang unggul. Kami juga dapat menyediakan layanan yang disesuaikan. Jika Anda tertarik dengan produk yang tidak ditampilkan, hubungi kami dan kami akan bekerja sama dengan Anda untuk memenuhi kebutuhan Anda.

Mengenai membaca:

Berbagi Laporan Validasi Kit ELISA RNA untai ganda (dsRNA) untuk Mempromosikan Standardisasi Deteksi dsRNA.

Referensi:

[1] Sousa R, Mukherjee S. T7 RNA polimerase[J]. Kemajuan dalam penelitian asam nukleat dan biologi molekuler, 2003: 1-41.

[2] Steitz T A. Perubahan struktural RNA polimerase T7 dari inisiasi transkripsi hingga perpanjangan [J]. Pendapat terkini dalam biologi struktural, 2009, 19(6): 683-690.

[3] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel BM, dkk. Penyortiran tetesan yang diaktifkan oleh fluoresensi untuk evolusi yang diarahkan oleh sel tunggal[J]. Biologi sintetis ACS, 2019, 8(6): 1430-1440.

[4] Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin C T. Penambahan ujung 3′ oleh RNA polimerase T7 bersifat RNA yang berpola sendiri, distributif, dan beragam—analisis RNA-Seq[J]. Penelitian asam nukleat, 2018, 46(18): 9253-9263.

[5] Dousis A, Ravichandran K, Hobert EM, dkk. Rekayasa polimerase RNA T7 yang menghasilkan mRNA bebas dari produk sampingan imunostimulasi[J]. Nature Biotechnology, 2023, 41(4): 560-568.