Apakah Anda mencari cara yang andal untuk mendeteksi residu dsRNA selama transkripsi mRNA in vitro? Tidak perlu mencari lebih jauh selain Kit ELISA RNA untai ganda (dsRNA). Namun, dengan beberapa kit komersial yang tersedia, penting untuk dicatat bahwa data validasi mungkin tidak selalu tersedia untuk umum, yang menyebabkan ketidakkonsistenan dalam deteksi dsRNA. Itulah sebabnya kami membagikan laporan validasi Kit ELISA RNA untai ganda (dsRNA), yang mencakup spesifisitas, presisi, akurasi, sensitivitas, dan daya tahan. Laporan ini berfungsi sebagai panduan referensi untuk memvalidasi metode deteksi residu dsRNA yang disesuaikan dengan kondisi eksperimen tertentu dan standar farmakope regulasi. Pelajari lebih lanjut tentang laporan validasi kami untuk mempromosikan standarisasi deteksi dsRNA.
ELISA RNA untai ganda (dsRNA) Bahasa Inggris: Kdia
Latar belakang:
Kit ELISA RNA untai ganda (dsRNA) merupakan kit reagen yang dirancang untuk mendeteksi sisa dsRNA yang diproduksi selama proses transkripsi mRNA secara in vitro. Dengan menggunakan prinsip eksperimen uji imunosorben terkait enzim (ELISA) sandwich antibodi ganda dan sistem amplifikasi biotin-streptavidin, kit ini menawarkan deteksi sensitif terhadap sisa dsRNA dalam sampel.
Data ringkasan berisi parameter validasi yang mencakup spesifisitas, presisi, akurasi, sensitivitas, dan daya tahan. Laporan tersebut berfungsi sebagai panduan referensi, yang mendorong pengguna untuk memvalidasi metode deteksi residu dsRNA yang disesuaikan dengan kondisi eksperimen spesifik mereka dan mematuhi standar farmakope yang berlaku.
Bahan dan Metode:
Peralatan: Kit ELISA RNA untai ganda (dsRNA): Cat#36717ES (
Metode: Bahan dan langkah prosedural yang penting untuk percobaan sebagian besar ditentukan oleh
Hasil
- Linearitas Standar dsRNA
Laporan ini telah mengembangkan kurva standar untuk keempat jenis standar dsRNA yang berbeda, masing-masing dengan panjang 300bp. Standar-standar ini meliputi STD1, dsRNA yang tidak dimodifikasi; STD2, dsRNA yang dimodifikasi Pseudo-UTP; STD3, dsRNA yang dimodifikasi N1-Me-Pseudo-UTP; dan STD4, dsRNA yang dimodifikasi 5-OMe-UTP. Setiap jenis standar dsRNA menunjukkan linearitas pengenceran yang sangat baik dengan R2 > 0,99 dan koefisien variasi (CV) konsentrasi terukur kurang dari 10% yang ditunjukkan pada Tabel 1 hingga Tabel 5.
| Nama STD | Tipe UTP | Linearitas pengenceran (R2＞(0,99) | Riwayat Hidup |
| STD1 | Bahasa Indonesia: UTP | 0.0156-1 pg/μL | ＜10% |
| STD2 | pUTP | 0,0156-1 pg/μL | ＜10% |
| STD3 | N1-Me-pUTP | 0,0312-1 pg/μL | ＜10% |
| STD4 | 5-OMe-UTP | 0,0625-1 pg/μL | ＜10% |
Tabel 1. Linearitas berbagai standar dsRNA.
| konsentrasi STD1N. (pg/μL) | Rata-rata yang diukur (pg/μL) | Pemulihan | Riwayat Hidup |
| 1 | 1.0001 | 100,0% | 3,1% dari |
| 0.5 | 0.4994 | 99,9% | 2,4% |
| 0,25 | 0.2516 | 100,7% | 3,3% |
| 0,125 | 0.1227 | 98,1% | 0,5% |
| 0,0625 pukul 0,0625 | 0,0640 tahun | 102,5% | 3,2% |
| 0,0312 | 0,0309 | 99,2% | 1,3% |
| 0,0156 | 0,0157 | 100,4% | 3,2% |
| angka 0 | / | / | / |
Tabel 2.Pemulihan dan CV dari STD1 yang diencerkan
| konsentrasi STD2N. (pg/μL) | Rata-rata yang diukur (pg/μL) | Pemulihan | Riwayat Hidup |
| 1 | 1.0001 | 100,0% | 0,7% |
| 0.5 | 0.4994 | 99,9% | 0,1% |
| 0,25 | 0.2514 | 100,6% | 0,9% |
| 0,125 | 0.1232 | 98,6% | 2,5% |
| 0,0625 pukul 0,0625 | 0,0635 pukul 0,0635 | 101,6% | 1,1% |
| 0,0312 | 0,0312 | 99,9% | 0,5% |
| 0,0156 | 0,0155 | 99,6% | 0,0% |
| angka 0 | / | / | / |
Tabel 3. Pemulihan dan CV dari STD2 yang diencerkan
| konsentrasi STD3. (pg/μL) | Rata-rata yang diukur (pg/μL) | Pemulihan | Riwayat Hidup |
| 2 | 2.0031 | 100,2% | 1.6% |
| 1 | 0,9880 | 98,8% | 2,4% |
| 0.5 | 0.5188 | 103,8% | 1,2% |
| 0,25 | 0.2383 | 95,3% | 2,2% |
| 0,125 | 0.1242 | 99,4% | 0,1% |
| 0,0625 pukul 0,0625 | 0,0629 pukul 0,0629 | 100,7% | 1,8% |
| 0,0312 | 0,0361 tahun | 115,7% | 1,6% |
| angka 0 | / | / | / |
Tabel 4. Pemulihan dan CV dari STD3 yang diencerkan
| konsentrasi STD4 (pg/μL) | Rata-rata yang diukur (pg/μL) | Pemulihan | Riwayat Hidup |
| 4 | 4.0096 | 100,2% | 1,9% |
| 2 | 1.9940 | 99,7% | 0,7% |
| 1 | 0,9977 tahun | 99,8% | 0,1% |
| 0.5 | 0.5108 | Nomor telepon 102.2% | 0,1% |
| 0,25 | 0.2454 | 98,2% | 5,6% dari total |
| 0,125 | 0.1207 | 96,5% | 2,8% |
| 0,0625 pukul 0,0625 | 0,0624 tahun | 99,9% | 0,3% |
| angka 0 | / | / | / |
Tabel 5. Pemulihan dan CV dari STD4 yang diencerkan
-
Kekhususan
- Analisis spesifisitas dengan dsRNA, ssRNA, dsDNA, dan ssDNA.
- Spesifisitas tidak dipengaruhi oleh panjang dsRNA.
-
Akeakuratan
Menambahkan 0,5 pg/μL STD1 terhadap sampel mRNA yang diketahui dengan kandungan dsRNA sebesar 0,36 pg/μL dilakukan dalam tiga rasio volume yang berbeda (1:1, 1:20, 1:250). Dalam semua kasus, tingkat pemulihan spike berada dalam kisaran 80-120%.
Tingkat pemulihan lonjakan dihitung sebagai berikut: Lonjakan Pemulihan Nilai=(Diukur konsentrasi setelah lonjakan×Total volume dari berduri sampel-Diukur konsentrasi dari itu sampel×Total volume dari itu sampel)/(Teoretis konsentrasi dari itu lonjakan×Volume dari itu lonjakan)×100%
| Sampel | Rasio Volume STD1/Sampel | dsRNA yang diukur Jumlah partikel (pg/μL) | Paku Pemulihan Kecepatan |
| Sampel (TS) | / | 0.36 | / |
| TS+0,5pg/μL STD1 | 1:1 | 0,769 tahun | 81% |
| TS+0,5pg/μL STD1 | Jam 1:20 | 0,777 tahun | 82% |
| TS+0,5pg/μL STD1 | Ukuran 1:250 | 0.803 | 82% |
Tabel 6. Tingkat pemulihan lonjakan analisa
-
Presisi
- Presisi intra-pengujian
Percobaan dilakukan pada tiga tingkat konsentrasi (tinggi, sedang, dan rendah) untuk masing-masing dari empat sampel standar dsRNA. Dalam satu percobaan, setiap sampel konsentrasi menjalani delapan kali pengujian berulang. Hasil menunjukkan koefisien variasi (CV) di bawah 15%. menunjukkan presisi intra-pengujian yang baik.
| STD1 | |||
| Teoretis konsentrasi Jumlah partikel (pg/μL) | Replikasi | Rata-rata yang diukur (pg/μL) | Riwayat Hidup |
| 1 | 8 | 1.0002 | 3,11% |
| 0,125 | 8 | 0.1230 | 0,46% |
| 0,0156 | 8 | 0,0164 tahun | 3,18% |
| STD2 | |||
| Teoretis konsentrasi Jumlah partikel (pg/μL) | Replikasi | Rata-rata yang diukur (pg/μL) | Riwayat Hidup |
| 1 | 8 | 1.0001 | 0,65% |
| 0,125 | 8 | 0.1231 | 2,46% |
| 0,0156 | 8 | 0,0162 | 0,02% |
| STD3 | |||
| Teoretis konsentrasi Jumlah partikel (pg/μL) | Replikasi | Rata-rata yang diukur (pg/μL) | Riwayat Hidup |
| 2 | 8 | 2.0022 | 1,58% |
| 0,25 | 8 | 0.2444 | 2,17% |
| 0,0312 | 8 | 0,0328 | 1,64% |
| STD4 | |||
| Teoretis konsentrasi Jumlah partikel (pg/μL) | Replikasi | Rata-rata yang diukur (pg/μL) | Riwayat Hidup |
| 8 | 8 | 8.0803 | 0,27% |
| 1 | 8 | 0.9650 | 0,12% |
| 0,125 | 8 | 0.1322 | 2.76% |
Tabel 7. Analisis presisi intra-assay
- Presisi antar pengujian
Tiga percobaan dilakukan dengan menggunakan kit dari 3 batch. Dalam setiap percobaan, konsentrasi tinggi, sedang, dan rendah dipilih dan diuji tiga kali untuk masing-masing dari empat sampel standar dsRNA, dengan delapan replikasi. Akibatnya, 24 titik data diperoleh pada setiap tingkat konsentrasi, yang kemudian digunakan untuk analisis koefisien variasi (CV). Hasilnya menunjukkan bahwa CV untuk setiap konsentrasi standar di bawah 15%.
| STD1 | |||
| Teoretis konsentrasi Jumlah partikel (pg/μL) | Tes/Replikasi Independen | Rata-rata yang diukur (pg/μL) | Riwayat Hidup |
| 1 | 3/8 | 1.0007 | 2,38% |
| 0,125 | 3/8 | 0.1186 | 3,20% |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0173 tahun | 1,27% |
| STD2 | |||
| Teoretis konsentrasi Jumlah partikel (pg/μL) | Tes/Replikasi Independen | Rata-rata yang diukur (pg/μL) | Riwayat Hidup |
| 1 | 3/8 | 0.9987 | 0,09% |
| 0,125 | 3/8 | 0.1269 | 1,06% |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0151 | 0,52% |
| STD3 | |||
| Teoretis konsentrasi Jumlah partikel (pg/μL) | Tes/Replikasi Independen | Rata-rata yang diukur (pg/μL) | Riwayat Hidup |
| 2 | 3/8 | 2.0012 | 2,37% |
| 0,25 | 3/8 | 0.2415 | 0,14% dari |
| 0,0312 | 3/8 | 0,0330 | 1,81% |
| STD4 | |||
| Teoretis konsentrasi Jumlah partikel (pg/μL) | Tes/Replikasi Independen | Rata-rata yang diukur (pg/μL) | Riwayat Hidup |
| 8 | 3/8 | 7.9735 | 1,89% |
| 1 | 3/8 | 1.0225 | 0,13% |
| 0,125 | 3/8 | 0.tahun 1227 | 5,63% |
Tabel 8. Analisis presisi antar pengujian
-
Kepekaan
- LOD
Batas deteksi perlengkapan ditentukan dengan menambahkan dua kali simpangan baku ke rata-rata nilai kosong. Dengan mengukur OD dari 24 kosong, menghitung rata-rata dan simpangan baku, dan kemudian menerapkan nilai-nilai ini ke kurva yang dipasang, batas deteksi yang sesuai diperoleh.
|
| DARI |
| ||
| dsRNA Standar | Rata-rata Kosong | SD dari Kosong | Rata-rata Blank+2SD | LOD |
| STD1 | 0,016 | 0,00048 | 0,01696 | ≤0,001pg/μL |
| STD2 | 0,016 | 0,00072 | 0,01744 tahun | ≤0,001pg/μL |
| STD3 | 0,034 tahun | 0,00119 | 0,03638 | ≤0,001pg/μL |
| STD4 | 0,115 | 0,00290 | 0.1208 | ≤0,01 pg/μL |
Tabel 9. Analisis LOD
- jumlah
Batasan kuantitatif dari perlengkapan ditetapkan dengan mengencerkan titik konsentrasi terendah kurva standar ke tingkat yang lebih rendah lagi, memastikan CV < 20% pada konsentrasi terendah, dengan demikian mendefinisikan ambang kuantitatif. LOQ adalah sebagai berikut.
| dsRNA Standar | jumlah | Replikasi | Riwayat Hidup(%) | Pemulihan (%) |
| STD1 | 0,0156 pg/μL | 24 | < 10% | 80~120% |
| STD2 | 0,0312 pg/μL | 24 | < 10% | 80~120% |
| STD3 | 0,0156 pg/μL | 24 | < 10% | 80~120% |
| STD4 | 0,125 pg/μL | 24 | < 10% | 80~120% |
-
Dkekerabatan
- Anti-interferensi pada bahan IVT
Tes ini bertujuan untuk menilai dampak berbagai enzim, buffer, dll., yang ditambahkan ke Bahasa Indonesia: sampel pada deteksi dsRNA oleh kit.
Menambahkan konsentrasi spesifik RNA polimerase T7, Inhibitor RNAse, IPPA (pirofosfatase anorganik), DNase I, VCE (enzim pembatasan vaksinia), 2'-O-Metiltransferase (MT), buffer 1×IVT, dan natrium sitrat 1mM ke sampel mRNA yang disediakan, dan kemudian menggunakan STD3 untuk persiapan kurva standar dan pengujian sampel, memungkinkan evaluasi kemampuan kit untuk mendeteksi kandungan dsRNA dalam sampel ini sampel. Hasilnya menunjukkan bahwa keberadaan delapan enzim dan buffer yang berbeda tidak memengaruhi deteksi dsRNA yang akurat. Selain itu, tingkat pemulihan yang diamati berada dalam kisaran 80% hingga 120%.
| Bahan IVT | dsRNA Terukur (pg/μL) | Pemulihan |
| Tidak ada | 0.6057 | 100% |
| Polimerase RNA T7 (15μg/mL) | 0.5411 | 89,32% |
| Penghambat RNase murine (27,5μg/mL) | 0.5142 | 84,88% |
| Pirofosfatase Anorganik (IPPA 10μg/mL) | 0.7132 | 117,7% |
| DNase I (13,75μg/mL) | 0.6077 | 100,32% |
| Enzim Pembatas Vaccinia (10μg/mL) | 0.6563 | 108,3% |
| 2´-O-Metiltransferase (10μg/mL) | 0,5776 tahun | 95,4% bahasa inggris |
| 1×penyangga IVT | 0.5003 | 82,6% |
| 1 juta Natrium sitrat | 0.6251 | 103,2% |
Tabel 11. Pemulihan STD3 encer yang ditambahkan dengan bahan IVT
- Suhu dkekerabatan
Perlengkapan tersebut disimpan di kedua tempat 4 derajat celcius dan 37°C untuk mendeteksi varians konsentrasi standar dsRNA setelah 7 hari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua varians berada dalam kisaran 20%.
| dsRNA Standar | dsRNA Diukur (pg/μL) Hari 0 | Varians setelah 7 hari pada suhu 4°C |
| STD1 | 1 | 10% |
| STD2 | 1 | 5% |
| STD3 | 2 | 7% |
| STD4 | 4 | 11% |
| dsRNA Standar | dsRNA Terukur (pg/μL) | Varians setelah 7 hari pada suhu 37°C |
| STD1 | 1 | 18% |
| STD2 | 1 | 4% |
| STD3 | 2 | 5% |
| STD4 | 4 | 8% |
Tabel 12. Analisis ketahanan suhu
Produk Terkait:
| Nama Produk | SKU | Spesifikasi |
| Kit ELISA RNA untai ganda (dsRNA) | 36717ES | Ukuran 48T/96T |
| CleaScrip™ T7 RNA Polimerase (RNA ds rendah, 250 U/μL) | 10628ES | 10/100 KU |
| Polimerase RNA T7 Kelas GMP (250 U/μL) | 10625ES | 10/100 KU |
Bacaan Terkait:
Kit ELISA RNA untai ganda (dsRNA) digunakan untuk memvalidasi mutan RNA polimerase T7 dsRNA rendah, bersama dengan metode dot blotting antibodi J2.
Mutasi Polimerase RNA T7 dsRNA Rendah, Memberdayakan Pengembangan Vaksin dan Terapi mRNA
Referensi:
- ICH, 2022: Validasi Metode Analisis Q2, versi draf.
- NMPA, 2007: Prinsip Umum untuk Evaluasi Validasi Metode Analisis untuk Analisis Pengendalian Kualitas Produk Biologi
- Komisi Farmakope Tiongkok (ChPC), 2020: Farmakope Tiongkok, Bagian Empat: Pedoman untuk Validasi Metode Analisis Kuantitatif untuk Sampel Biologis