Pengembangan T7 RNA polimerase (DSRNA rendah) dengan transferase terminal yang lebih rendah dan aktivitas RDRP melalui FAD dan desain semi-rasional.

Dalam beberapa tahun terakhir, obat berbasis mRNA telah menarik perhatian signifikan dan menarik fokus penelitian. T7 RNAP dikenal karena kesederhanaannya dan kemampuannya untuk mengkatalisis sintesis RNA dengan hasil tinggi dan kesetiaan in vitro. Namun, selama proses transkripsi, T7 RNAP dapat menghasilkan produk sampingan seperti RNA pendek yang gagal, RNA yang dihentikan sebelum waktunya, dan RNA yang diperpanjang 3', yang menciptakan kondisi yang menguntungkan untuk pembentukan dsRNA. Oleh karena itu, mengurangi produksi dsRNA telah menjadi kebutuhan mendesak dalam aplikasi praktis.

Baru-baru ini, sebuah studi inovatif berjudul "FADS dan modifikasi desain semi-rasional RNA polimerase T7 mengurangi produksi dsRNA, dengan aktivitas transferase terminal dan RDRP yang lebih rendah"diterbitkan secara online oleh Yeasen dan Tim Molefuture. Para peneliti berhasil merekayasa T7 RNAP untuk secara signifikan mengurangi produksi produk sampingan dsRNA selama transkripsi, menguranginya hingga 1,8% dari enzim tipe liar melalui kombinasi evolusi terarah dan desain semi-rasional.

Skrining T7 RNAP berbasis FADS

Untuk penyaringan T7 RNAP, FADS (Fluorescence-activated droplet sorting) dipilih untuk memenuhi persyaratan throughput tinggi dari evolusi protein. Untuk mencegah fragmentasi dini sel, Peneliti menggunakan chip PDMS dengan dua fase air, di mana lisozim dicampur dengan sel-sel pada chip dan mengerahkan aktivitasnya di dalam tetesan. Gambar 1Para peneliti menghasilkan beberapa perpustakaan mutan acak dengan keragaman berkisar antara 10⁵ ke10⁶Setelah penyaringan, 10 varian dominan diidentifikasi dan ditetapkan sebagai Mut1 hingga Mut10.  Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2E Dan Gambar 2F, kandungan dsRNA pada Mut1, Mut7, dan Mut9 secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan tipe liar

Gambar 1. Gambaran Umum FADS

Gambar 2. Penyaringan pustaka acak dan evaluasi varian

Desain semi-rasional T7 RNAP

Peneliti melakukan eksplorasi desain semi-rasional, membuat sepuluh perpustakaan jenuh situs tunggal dan menggunakan metode probe ganda berbasis pelat mikrotiter tradisional untuk penyaringan (Gambar 3). Probe ujung 5' yang ditambahkan digunakan untuk mendeteksi hasil RNA.

Gambar 3. Desain semi-rasional yang dipandu struktur untuk penurunan dsRNA

Setelah menyaring lebih dari 1000 mutan, Peneliti mengidentifikasi enam kandidat: Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H), dan Mut16 (I743L). Total hasil RNA dari keenam mutan tersebut tidak berbeda secara signifikan dari tipe liar, yang menunjukkan efisiensi transkripsi keseluruhan yang sebanding. Diharapkan, kandungan dsRNA dari Mut11 dan Mut14 secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan tipe liar.Gambar 4).

Gambar 4. Skrining pelat mikrotiter dan evaluasi varian

Mut17 dari pengocokan DNA menghasilkan lebih sedikit dsRNA

Untuk lebih mengoptimalkan T7 RNAP, empat varian dengan kandungan dsRNA rendah sekaligus memenuhi persyaratan produksi dipilih.Para peneliti kemudian menyusun perpustakaan DNA shuffling dan menyaringnya dengan pelat mikrotiter, mengidentifikasi varian yang menunjukkan produksi dsRNA lebih rendah dibandingkan dengan RNAP T7 induknya, yang diberi nama Mut17 (A70Q/F162S/K180E). Mereka kemudian menganalisis produk transkripsi Mut17 dan varian induknya (Mut14, Mut11, dan Mut7). Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 5, keempat varian menunjukkan pengurangan signifikan dalam produksi dsRNA selama transkripsi dibandingkan dengan tipe liar. Hebatnya, Mut17 menunjukkan kandungan dsRNA yang jauh lebih rendah, hanya 1,80% dan serendah 0,007 ng/μg dalam sistem pelarut penyaringan.

Gambar 5. Kandungan dsRNA Mut17 dan mutasi induknya

Imunogenisitas produk IVT dari mutan secara signifikan lebih rendah daripada tipe liar.

Berikutnya, Kami mengevaluasi imunogenisitas produk IVT pada tikus RAW264.7 sel. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2A dan 2B, tingkat mRNA dan protein IFN-β berkurang pada RAW264.7 sel ditransfeksi dengan mRNA yang diproduksi oleh mutan dibandingkan dengan tipe liar, menunjukkan bahwa mRNA yang disintesis oleh T7 RNAP tipe liar memunculkan respons imun terkuat, sementara mRNA dari mutan menunjukkan respons yang berkurang secara signifikan. Secara khusus, mRNA IFN-β dari sel yang diobati dengan RNA Mut11 hanya 9,7% dari sel yang diobati dengan tipe liar, dan proteinnya adalah 12,93 pg/mL. Selain itu, ekspresi EGFP tidak menunjukkan perbedaan signifikan dalam kuantitas atau kualitas di antara mRNA yang dihasilkan oleh RNAP T7 yang berbeda. (Gambar 6C), memenuhi persyaratan untuk aplikasi industri.

Gambar 6. Respons IFN-β dan ekspresi EGFP pada sel mamalia

Aktivitas RDRP dan transferase terminal mutan jauh lebih rendahKamir daripada tipe liar.

Untuk menyelidiki dampak mutasi pada pengurangan dsRNA, para peneliti dilakukan studi in silico pada semua mutasi ini. Hasilnya menunjukkan indikasi yang jelas tentang berkurangnya aktivitas RDRP pada varian tersebut, karena mereka menunjukkan kecenderungan yang menurun untuk menggunakan RNA sebagai cetakan. Demikian pula, hal ini mungkin berdampak pada aktivitas transferase terminal T7 RNAP. Seperti yang ditunjukkan pada Angka 7, pada konsentrasi yang berbeda, keempat varian menunjukkan kurang dari 50% nilai fluoresensi dibandingkan dengan tipe liar.

Selanjutnya, uji heterogenitas ujung 3' digunakan untuk mengkarakterisasi aktivitas transfer terminal T7 RNAP. Ketika berfokus pada proporsi RNA dengan n>0, yang mencerminkan aktivitas transferase terminal, para peneliti menemukan bahwa RNA ini mencapai 82,94% pada tipe liar, sedangkan mutan menunjukkan persentase berikut: Mut11 (70,29%), Mut7 (67,88%), Mut14 (63,31%), dan Mut17 (55,62%). (Angka 8)Yang penting, persentase ini sangat konsisten dengan kelimpahan dsRNA dalam produk (Gambar 5)Hasil ini menunjukkan adanya penurunan signifikan aktivitas terminal transferase pada mutan, yang bersama dengan penurunan aktivitas RDRP, berkontribusi terhadap penurunan dsRNA.Secara khusus, aktivitas terminal transferase mungkin memainkan peran yang lebih penting, sebagaimana dibuktikan oleh akumulasi terendah RNA n>0 yang diamati pada Mut17, yang juga menunjukkan produksi dsRNA terendah. (Gambar 5 dan Gambar 8).

Angka 7Aktivitas RDRP relatif

Angka 8Heterogenitas pada produk RNA ujung 3'

Kesimpulan

Studi ini memberikan metodologi yang kuat untuk mengidentifikasi mutan dengan kandungan dsRNA yang berkurang dan berhasil mengisolasi beberapa mutan dsRNA yang memiliki aktivitas RNA polimerase dan terminal transferase yang bergantung pada RNA yang berkurang. Studi ini secara substansial mendukung validasi keamanan dan kemanjuran yang tidak terpisahkan dari terapi mRNA, menggarisbawahi implikasinya yang mendalam untuk memajukan vaksin mRNA dan aplikasi terapi gen.

Pada saat yang sama, perusahaan induk Yeasen juga meluncurkan produk T7 RNAP yang secara signifikan mengurangi dsRNA konten. Beberapa mitra telah menguji mutan T7 RNAP yang dimodifikasi yang dikembangkan oleh Molefuture dan produk ini telah sangat diakui oleh pelanggan. Pelanggan kami percaya bahwa penggunaan enzim baru menyederhanakan proses pemurnian mRNA dan sangat mengurangi imunogenisitas IVT produk, menunjukkan kinerja yang luar biasa dalam berbagai skenario aplikasi, membuktikan potensi penerapannya yang luas di bidang biofarmasi!

Informasi Pemesanan

Berikut ini adalah produk representatif yang ditawarkan oleh Yeasen. Ukuran tambahan tersedia. Produk kami sangat dioptimalkan untuk bekerja sama, guna membantu memastikan kinerja dan reproduktifitas yang unggul. Kami juga dapat menyediakan layanan yang disesuaikan. Jika Anda tertarik dengan produk yang tidak ditampilkan, hubungi kami dan kami akan bekerja sama dengan Anda untuk memenuhi kebutuhan Anda.