Dalam pengurutan berthroughput tinggi, konstruksi pustaka konvensional memerlukan amplifikasi PCR. Di satu sisi, hal itu untuk mengamplifikasi sampel DNA jejak dan meningkatkan hasil pustaka. Di sisi lain, hal itu dapat mengamplifikasi sinyal fluoresen, sehingga memudahkan sequencer untuk menangkap dan mengidentifikasi sinyal fluoresen guna meningkatkan akurasi pengurutan. Namun, PCR seperti "pedang bermata dua". Sambil memecahkan masalah volume sampel awal yang rendah dan mengamplifikasi sinyal fluoresen, hal itu juga menimbulkan kesalahan dan bias amplifikasi, dan tidak dapat secara sempurna menyajikan urutan genom "Wajah sebenarnya". Selain itu, PCR polimerase memiliki bias amplifikasi tertentu. Beberapa daerah, terutama GC tinggi atau GC rendah, struktur sekunder, dan daerah lainnya, memiliki efisiensi amplifikasi yang rendah dan sulit untuk dicakup. Hal itu juga akan menimbulkan sejumlah besar InDel yang salah dan mendatangkan sejumlah besar Duplikasi. , yang menyebabkan pemborosan volume data DNA dan meningkatkan biaya pengurutan. Oleh karena itu, pengenalan teknologi PCR-Free tidak hanya memiliki keunggulan PCR tetapi juga mengatasi kekurangan PCR. Ia tidak hanya dapat menghadirkan pustaka berkualitas tinggi dengan sensitivitas tinggi, dan mewujudkan deteksi sampel jejak, tetapi juga memiliki akurasi tinggi dan mengurangi beban kerja Validasi tindak lanjut untuk studi varian. Jadi, apa sebenarnya pustaka PCR-Free dan apa saja kelebihannya?

1. Apa itu pustaka PCR-Free?
2. Apa keuntungan teknologi PCR-Free?
3. Tampilan data PCR-Bebas
4. Tanya Jawab
5. Informasi produk
6. Mengenai membaca

1. Apa itu pustaka PCR-Free?

Teknologi sekuensing generasi berikutnya merupakan teknologi yang paling umum digunakan dalam penelitian sekuensing berthroughput tinggi dalam biologi molekuler modern. Sekuensing generasi pertama tradisional tidak lagi dapat sepenuhnya memenuhi kebutuhan peneliti. Re-sekuensing genom organisme model dan sekuensing genom organisme non-model memerlukan biaya lebih besar. Teknologi sekuensing yang rendah, throughput lebih tinggi, dan lebih cepat, sehingga melahirkan teknologi sekuensing generasi kedua. Prinsip inti dari teknologi sekuensing generasi kedua adalah sekuensing-dengan-sintesis, yaitu, untuk menentukan sekuens DNA dengan menangkap informasi basa berlabel akhir yang baru disintesis. Prinsip utama teknologi sekuensing generasi kedua untuk sekuensing DNA adalah pertama-tama memecah DNA, memperbaiki ujung DNA yang terfragmentasi, dan kemudian menambahkan adaptor spesifik di kedua sisi dan kemudian menggunakan metode yang berbeda untuk menghasilkan jutaan PCR yang difiksasi secara spasial. Untuk larik klonal, data sekuensing diperoleh menggunakan hibridisasi primer dan reaksi ekstensi enzimatik untuk mencitrakan label fluoresen yang dimasukkan oleh setiap reaksi ekstensi.

Pengurutan DNA dengan pengurutan generasi berikutnya terutama mencakup dua proses: persiapan pustaka dan pengurutan pada mesin. Selama persiapan pustaka, fragmen genom yang terputus secara acak biasanya diperkuat dengan PCR standar. Namun, untuk beberapa templat khusus, ada faktor-faktor seperti struktur sekunder yang kompleks atau stabilitas termal yang buruk, yang memengaruhi preferensi amplifikasi PCR templat, sehingga tidak semua urutan genom dapat tercermin secara merata di pustaka amplifikasi PCR. Terutama untuk beberapa templat dengan konten GC atau AT tinggi, terkadang sulit untuk menggunakan metode PCR untuk memperkuat konstruksi pustaka. Tidak ada perbedaan antara pustaka bebas PCR dan pustaka PCR konvensional saat mengurutkan pada mesin, kecuali bahwa PCR tidak dilakukan selama proses konstruksi pustaka. Pustaka bebas PCR secara teoritis dapat meningkatkan distribusi pembacaan data dan menghasilkan cakupan genom yang lebih seragam.Pustaka bebas PCR merupakan pelengkap metode konstruksi pustaka. Karena disiapkan langsung ke dalam pustaka bawaan tanpa amplifikasi PCR, pustaka ini dapat meningkatkan cakupan beberapa daerah GC atau AT tinggi, sehingga mengurangi basis kesalahan yang disebabkan oleh PCR, bias data, dan pengulangan sekuens.

Langkah inti dari konstruksi pustaka NGS konvensional adalah fragmentasi genom, perbaikan ujung, penambahan adaptor, PCR, dan amplifikasi sinyal sebelum pengurutan. Jadi, bagaimana dengan konstruksi pustaka Bebas PCR? Seperti namanya, ini adalah proses pembangunan pustaka yang tidak memerlukan PCR. Langkah inti dari konstruksi pustaka adalah fragmentasi genom, modifikasi ujung, penambahan penghubung, dan kontrol kualitas pustaka. Namun pada kenyataannya, ini hanya dapat dianggap Bebas PCR dalam proses konstruksi pustaka. Bebas PCR yang sebenarnya seharusnya merupakan proses dari konstruksi pustaka hingga pengurutan tanpa amplifikasi pustaka (seperti teknologi pengurutan molekul tunggal) atau teknologi pengurutan tanpa akumulasi kesalahan amplifikasi PCR (seperti DNBseq MGI).

Gambar 1. Diagram alir pembangunan perpustakaan konvensional dan pembangunan perpustakaan PCR-Free

2. Apa keuntungan teknologi PCR-Free?

Dalam proses konstruksi pustaka rutin, enzim amplifikasi dapat menimbulkan kesalahan. Melalui amplifikasi siklik, kesalahan ini akan terakumulasi dan diamplifikasi, sehingga mengurangi kesetiaan replikasi sekuens DNA. Selain itu, DNA polimerase juga memiliki bias amplifikasi tertentu, terutama untuk daerah dengan perbedaan besar dalam kandungan GC atau struktur sekunder, yang mengakibatkan efisiensi amplifikasi rendah dan keseragaman cakupan yang buruk; saat memperkenalkan InDel yang salah, itu juga akan membawa sejumlah besar Duplikasi menyebabkan pemborosan volume data DNA dan meningkatkan biaya sekuensing. Teknologi PCR-Free dapat dengan baik menghindari masalah yang disebutkan di atas yang diperkenalkan oleh amplifikasi PCR dalam konstruksi pustaka konvensional. Dalam proses konstruksi dan sekuensing pustaka, jika ada proses amplifikasi PCR, itu akan memiliki dampak yang lebih besar pada keseragaman cakupan genom. Untuk templat DNA, beberapa memiliki struktur sekunder yang kompleks dan beberapa memiliki perbedaan besar dalam stabilitas termal. Faktor-faktor ini akan memengaruhi efisiensi amplifikasi PCR. Oleh karena itu, dalam proses amplifikasi PCR, tidak dapat dijamin bahwa semua fragmen genom dapat memperoleh efisiensi amplifikasi yang sama, tetapi ada bias amplifikasi yang jelas, seperti cakupan rendah di daerah GC tinggi atau GC rendah genom. Namun, tidak ada PCR dalam seluruh proses sekuensing PCR-Free. Dibandingkan dengan konstruksi pustaka PCR, cakupan daerah GC tinggi dan daerah pengulangan AT/TA genom ditingkatkan. Keuntungan spesifiknya adalah sebagai berikut.

2.1 Proses persiapan perpustakaan yang efisien, menghemat waktu

Persiapan perpustakaan bebas PCR menghilangkan kebutuhan untuk amplifikasi PCR dan langkah-langkah lainnya, menyederhanakan proses persiapan perpustakaan dan menghemat waktu.

2.2 Mengurangi biaya persiapan perpustakaan

Dalam proses penyiapan pustaka konvensional, enzim berfidelitas tinggi yang mahal digunakan untuk amplifikasi PCR guna memastikan keaslian sekuens. Pada saat yang sama, PCR-Free menghilangkan langkah amplifikasi PCR, sehingga mengurangi biaya penyiapan pustaka.

2.3 Mengurangi bias amplifikasi

Enzim amplifikasi DNA memiliki bias amplifikasi tertentu, terutama untuk templat dengan perbedaan signifikan dalam kandungan GC atau struktur sekunder. Oleh karena itu, PCR-Free dapat secara efektif menghindari bias amplifikasi yang disebabkan oleh polimerase.

2.4 Tidak Ada Duplikasi PCR

PCR-Free dapat mengurangi Duplikat pembacaan dan meningkatkan tingkat Pemetaan Unik serta pemanfaatan data yang efektif.

2.5 Mengurangi Kesalahan Pare

Amplifikasi PCR lebih mungkin menimbulkan kesalahan replikasi Penyisipan & Penghapusan, sehingga mengakibatkan Tingkat Kesalahan yang lebih tinggi pada pengurutan Indel, sedangkan PCR-Bebas dapat secara efektif menghindari pembentukan dan akumulasi kesalahan tersebut.

3. Tampilan data PCR-Bebas

Kit Persiapan Pustaka DNA Gratis PCR Hieff NGS™ Ultima Pro V2 (Cat# 12196ES) memiliki tingkat konversi perpustakaan yang lebih baik daripada produk pesaing.

Gambar 2. Jumlah data sekuensing off-machine untuk konstruksi pustaka PCR-Free

4. Tanya Jawab

T: Jenis sampel apa yang cocok untuk perpustakaan bebas PCR?

A: Beberapa sampel dengan struktur sekunder yang kompleks, GC tinggi, dan preferensi PCR dapat memilih pustaka bebas PCR untuk dibangun.

T: Berapa ukuran fragmen umum dari pustaka bebas PCR?

A: Pustaka bebas PCR sendiri tidak memiliki persyaratan khusus pada ukuran fragmen. Pustaka produk PCR, pustaka dibangun sesuai dengan ukuran produk PCR. Untuk pustaka genomik, direkomendasikan sekitar 350bp, sehingga kualitas data pustaka relatif baik.

5. Informasi produk

Produk yang Yeasen dapat disediakan ditunjukkan pada Tabel 1.

Tabel 1. Informasi produk

6. Mengenai membaca

Solusi untuk persiapan perpustakaan NGS dari sampel DNA

Tentang teknologi terkait NGS, seberapa banyak yang Anda ketahui?