I. Prinsip Western Blot
Western Blot (WB), atau protein immunoblotting, adalah teknik klasik untuk mendeteksi protein tertentu berdasarkan interaksi antigen-antibodi, yang banyak digunakan dalam biologi molekuler, imunologi, dan bidang terkait. Langkah-langkah intinya meliputi:
- Pemisahan Protein:
- SDS-PAGE memisahkan protein terdenaturasi berdasarkan berat molekul.
- SDS melapisi protein dengan muatan negatif yang seragam, menghilangkan pengaruh struktural.
- Transfer Membran:
- Protein dipindahkan dari gel ke membran (misalnya, PVDF atau nitrocellulose).
- Deteksi Antibodi:
- Antibodi primer secara khusus mengikat protein target, diikuti oleh antibodi sekunder terkonjugasi enzim (misalnya, HRP) yang menghasilkan sinyal yang dapat dideteksi, seperti kemiluminesensi.
II. Alur Kerja Western Blot Standar
| Melangkah | Prosedur Utama | Reagen yang Direkomendasikan ( |
| 1. Persiapan Sampel | Ekstrak protein dengan buffer lisis RIPA; tambahkan PMSF untuk menghambat protease aktivitas. | Seri Penyangga Lisis RIPA, PMSF |
| 2. Kuantifikasi Protein | Gunakan metode BCA (Kucing#20200ES) untuk kuantifikasi; cocokkan buffer pengenceran standar dengan buffer sampel. | Kit Kuantifikasi BCA (Kucing#20200ES/Tahun 20201ES) |
| 3. Elektroforesis SDS-PAGE | Gunakan gel pracetak, jalankan pada 150 V hingga pewarna mencapai dasar gel. | Gel Pracetak, Penyangga Pemuatan SDS-PAGE |
| 4. Transfer & Pemblokiran Membran | Mengaktifkan membran PVDF (Kucing #36125ES) dengan merendam dalam metanol selama 1 menit; transfer pada 300 mA selama 60 menit dalam penangas es; blok pada suhu kamar (RT) selama 1 jam atau gunakan larutan pemblokiran cepat (Kucing #36122ES) selama 10 menit. | Bahasa InggrisBuffer Ansfer, Seri Membran PVDF |
| 5. Inkubasi Antibodi | Inkubasi dengan antibodi primer pada suhu 4°C semalaman; antibodi sekunder pada suhu ruangan selama 1-2 jam; cuci dengan TBST 3x secara menyeluruh. | Pengencer Antibodi |
| 6.Deteksi Protein | Kembangkan dengan ECL (Kucing #36208ES). | Seri Chemiluminescence ECL |
Gambar 1: Alur Kerja Western Blot
III. Masalah Umum dan Solusinya
| Masalah | Kemungkinan Penyebab | Solusi |
| Latar Belakang Tinggi  | Pemblokiran tidak lengkap | Gunakan larutan pemblokiran baru dan perpanjang waktu pemblokiran. |
| Pencucian yang tidak memadai | Tingkatkan frekuensi dan durasi pencucian untuk menghilangkan ikatan yang tidak spesifik. | |
| Konsentrasi antibodi primer yang berlebihan | Encerkan antibodi hingga konsentrasi yang tepat. | |
| Contoh masalah kualitas | Periksa kemurnian dan kualitas sampel; gunakan sampel segar. | |
| Pengeringan membran | Pastikan membran tetap terhidrasi selama langkah inkubasi; pastikan kontak penuh dengan larutan reaksi. | |
| Sinyal Lemah atau Tidak Ada  | Transfer tidak lengkap | Verifikasi efisiensi transfer dan sesuaikan waktu sesuai kebutuhan. |
| Membran PVDF yang tidak aktif | Rendam PVDF dalam metanol untuk mengaktifkannya sebelum dipindahkan ke buffer. | |
| Ketidakcocokan antibodi primer dengan spesies target | Periksa lembar data, bandingkan urutan imunogen dan protein, dan sertakan kontrol positif yang banyak digunakan (misalnya, β-aktin pada sel mamalia). | |
| Ketidakcocokan antibodi primer dan sekunder | Pastikan antibodi sekunder cocok dengan spesies inang antibodi primer. | |
| Ikatan antibodi tidak mencukupi | Tingkatkan konsentrasi antibodi dan perpanjang inkubasi pada suhu 4°C (misalnya, semalaman). | |
| Tingkat antigen rendah | Muat setidaknya 20-30 μg protein per jalur; gunakan inhibitor protease dan kontrol positif. | |
| Ekspresi protein target rendah | Konfirmasikan ekspresi dalam sampel melalui literatur/basis data; konsentrasikan sampel atau gunakan kontrol ekspresi tinggi. | |
| Pita Non-Spesifik/Beberapa Pita  | Garis sel yang melewati batas dapat mengubah profil protein | Gunakan sel lintasan rendah (<15 lintasan) dan jalankan kontrol paralel dengan stok lintasan awal. |
| Degradasi protein | Sertakan inhibitor protease dalam buffer lisis; simpan pada suhu -80°C, hindari pembekuan-pencairan, gunakan sampel segar. | |
| Modifikasi pasca-translasi | Periksa literatur untuk modifikasi yang memengaruhi ukuran pita (misalnya, ubikuitinasi, glikosilasi). | |
| Beberapa varian sambungan | Verifikasi varian sambungan melalui literatur atau basis data. | |
| Dimer/multimer protein | Tambahkan β-merkaptoetanol atau DTT segar ke buffer pemuatan SDS. | |
| Kontaminasi protein eksogen | Periksa protein eksogen; ganti lini sel jika diperlukan. | |
| Pemuatan sampel berlebihan | Optimalkan pemuatan (20-30 μg) berdasarkan ekspresi target melalui pengujian gradien. | |
| Pembentukan multimer | Rebus sampel selama 10 menit untuk memisahkan multimer | |
| Konsentrasi antibodi primer yang tinggi | Kurangi konsentrasi dan/atau waktu inkubasi untuk menghindari pita tambahan. | |
| Konsentrasi antibodi sekunder tinggi | Konsentrasi lebih rendah dan sertakan kontrol sekunder saja untuk mengurangi pengikatan non-spesifik. | |
| Deteksi protein atau anggota keluarga yang tidak dilaporkan | Tinjau literatur atau BLAST; gunakan lini sel/jaringan yang direkomendasikan. | |
| Jika diverifikasi, Anda mungkin telah menemukan protein baru! | ||
| Pita Tersenyum  | Migrasi cepat, suhu buffer tinggi, kelebihan beban, buffer rendah | Migrasi lambat, pra-dinginkan buffer, kurangi beban protein, pastikan buffer menutupi sumur sepenuhnya. |
| Pita Berkerut  | Masalah perangkat (misalnya, gelembung di bawah gel) | Sesuaikan pengaturan untuk menghilangkan gelembung dan memastikan polimerisasi gel yang merata. |
| Pita Pengikat  | Kelarutan sampel buruk, degradasi, buffer yang digunakan kembali | Campur sampel dengan baik, gunakan sampel segar, siapkan buffer lari segar. |
| Pita Berbentuk Barbel  | Gel tidak rata polimerisasi, sampel tidak murni | Cetak ulang gel untuk keseragaman; sentrifus sampel sebelum digunakan. |
| Pengolesan Pita  | Beban berlebihan, kualitas gel buruk | Kurangi volume sampel, tingkatkan persiapan gel. |
| Tanda Gelembung  | Udara terperangkap selama pemindahan | Hilangkan gelembung saat merakit sandwich transfer. |
| Bintik Hitam Tidak Merata  | Larutan pemblokiran yang tidak larut, distribusi antibodi tidak merata | Larutkan sepenuhnya larutan pemblokiran, cuci 3x dengan TBST, aduk selama inkubasi. |
| Bercak Putih  | Substrat pengurang konsentrasi antibodi tinggi | Konsentrasi antibodi primer/sekunder yang lebih rendah. |
Ⅳ.Alat Pemilihan dan Optimalisasi Produk
Produk Terkait:
| Prosedur | Nomor Kucing. | Nama Produk | Spesifikasi |
| Persiapan Sampel | tahun 20101ES | Penyangga lisis RIPA (kuat) | 100 ml air |
| tahun 20115ES | Penyangga Lisis RIPA (Sedang) | 100 ml air | |
| tahun 20114ES | Penyangga lisis RIPA (Lemah) | 100 ml air | |
| tahun 20118ES | Penyangga Lisis untuk Pengujian WB/IP | 100 ml air | |
| Kit Kuantifikasi Protein BCA (Ditingkatkan) | 500T/2500T/5000T | ||
| Kit Kuantifikasi Protein BCA (Siap pakai) | 500 ribu | ||
| Elektroforesis SDS-PAGE | Penanda Protein Rentang Reguler 3-warna Gold Band Plus (8-180 kDa) | 250 μL/2×250 μL/10×250 μL | |
| Penanda Protein Jangkauan Tinggi 3-warna GoldBand™ (10-245 KDa) | 2×250 μL/10×250 μL | ||
| 20328ES | Kit Persiapan Gel SDS-PAGE | 1 kit (30~50 gel)/ 1 kit (150~250 gel) | |
| Kit Persiapan Cepat Gel PAGE | Konsentrasi: 8%, 10%, 12,5%, 15% | ||
| Nomor telepon 36259ES-36280ES | Gel Protein Pracetak Plus | Konsentrasi: 8%、10%、12%、4-12%、4-20% Opsi Pemuatan Sumur: 10 sumur、12 sumur、15 sumur | |
|
Transfer & Pemblokiran Membran | Membran PVDF 0,45 μm (1 rol, 30cm×3m) | 1 gulungan | |
| Membran PVDF 0,22 μm (1 rol, 30cm×3m) | 1 gulungan | ||
| Inkubasi Antibodi | 36206ES | Pengencer Antibodi Primer & Sekunder untuk WB | 100ml/500ml |
|
Deteksi Protein | Reagen Deteksi Super ECL | 100ml/500ml | |
| Kit Substrat Chemiluminescent ECL yang Disempurnakan | 100ml/500ml |
Bahasa Indonesia: V.Cara Mendapatkan Dukungan
Untuk pemecahan masalah yang dipersonalisasi atau pengoptimalan protokol:
- Mengunjungi:
Yeasen Halaman Produk Western Blot - E-mail: info@yeasenbio.com
Aturan Emas untuk Sukses: Prosedur standar + reagen berkualitas tinggi + validasi langkah demi langkah = hasil WB yang dapat direproduksi!