Keterangan
Kit Sintesis RNA Hasil Tinggi T7 mengoptimalkan sistem reaksi transkripsi. Kit ini dapat mensintesis RNA untai tunggal secara efisien dengan menggunakan RNA polimerase T7, DNA untai ganda linier dengan urutan promotor T7 sebagai cetakan, NTP sebagai substrat untuk mengendalikan urutan DNA di hilir promotor. Selama transkripsi, nukleotida yang dimodifikasi dapat ditambahkan ke substrat untuk menyiapkan biotin atau RNA berlabel pewarna.
Kit ini dapat mensintesis transkrip panjang dan transkrip pendek, RNA dapat diproduksi 100-200 μg dengan input cetakan DNA 1 μg. RNA yang disintesis melalui transkripsi dapat digunakan untuk berbagai aplikasi hilir, seperti penelitian struktur dan fungsi RNA, perlindungan RNase, hibridisasi probe, RNAi, mikroinjeksi, dan in vitro. terjemahan.
Gambar 1: In vitro Proses transkripsi RNA
Fitur
- Hingga 180 μg RNA per reaksi dari 1 μg templat kontrol
- Sistem reaksi yang dioptimalkan untuk proses IVT
- Mengurangi produksi dsRNA
- Integritas dan kemurnian RNA yang lebih tinggi
Aplikasi
- Dalam tabung reaksi Sintesis RNA
Komponen
| Komponen No. | Nama | 10623ES50 (50T) | 10623ES60 (100 ton) | 10623ES70 (500 ton) |
| 10623-A | Campuran RNA Polimerase T7 | 100 mikroliter | 200 mikroliter | 1 ml air |
| 10623-B | 10×Penyangga Transkripsi | 100 mikroliter | 200 mikroliter | 1 ml air |
| 10623-C | ATP (100mM) | 100 mikroliter | 200 mikroliter | 1 ml air |
| 10623-D | CTP (100mM) | 100 mikroliter | 200 mikroliter | 1 ml air |
| 10623-E | GTP (100mM) | 100 mikroliter | 200 mikroliter | 1 ml air |
| 10623-F | UTP (100mM) | 100 mikroliter | 200 mikroliter | 1 ml air |
| 10623-G | Template DNA Kontrol (500ng/μL) | 10 mikroliter | 20 mikroliter | 100 mikroliter |
Pengiriman dan Penyimpanan
Transportasi es kering. Simpan pada suhu -15℃ ~ -25℃, berlaku selama dua tahun.
Angka
Gambar 1. RNA standar disintesis secara in vitro menggunakan kit sintesis RNA T7.
Reaksi diinkubasi dalam instrumen PCR pada suhu 37℃ selama 2 jam dan kemudian dimurnikan dengan manik-manik magnetik (Cat#12602). Hasil rendemen dianalisis dengan spektrofotometer NanoDrop seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 2. Demonstrasi transkripsi RNA dengan panjang yang berbeda oleh kit T7 masing-masing dalam elektroforesisogram (Gambar 2A), diagram elektroforesis kapiler (Gambar 2B), dan kromatogram (Gambar 2C)
Gambar 3. Sintesis RNA yang ditutup secara in vitro.
Reaksi diinkubasi dalam instrumen PCR pada suhu 37℃ selama 2 jam, lalu dimurnikan dengan manik magnetik (Cat#12602). Hasil rendemen diuji dengan spektrofotometer NanoDrop seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3A. Hasil integritas dianalisis dengan elektroforesis kapiler seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3B.
1. Hasil transkrip rendah
Kualitas pola sangat erat kaitannya dengan hasil. Jika hasil kelompok eksperimen secara signifikan lebih rendah daripada kelompok kontrol, kemungkinan penyebabnya adalah:
① templat eksperimen mengandung komponen penghambat;
② Ada yang salah pada template.
Saran:
① Bersihkan kembali template;
② Tentukan kuantifikasi templat dan integritasnya;
③ Memperpanjang waktu reaksi;
④ Meningkatkan jumlah input template;
⑤ Cobalah promotor dan RNA polimerase lainnya.
2. Hasil transkrip pendek rendah
Fragmen inisiasi transkripsi yang pendek akan menghambat reaksi. Jika produk transkripsi kurang dari 100 nt, memperpanjang waktu reaksi menjadi 4-8 jam atau menambah jumlah templat menjadi 2 μg akan meningkatkan hasil RNA.
3. Panjang transkripsi RNA lebih besar dari yang diharapkan
Jika elektroforesis menunjukkan pita produk lebih besar dari ukuran yang diharapkan, kemungkinan penyebabnya adalah:
①Templat plasmid mungkin tidak sepenuhnya terlinearisasi;
②Ujung 3' dari untai sensor memiliki struktur yang menonjol;
③RNA memiliki struktur sekunder yang tidak terdenaturasi sepenuhnya.
Saran:
①Periksa apakah templat sepenuhnya terlinearisasi, dan jika perlu, lakukan linearisasi tambahan;
②Pilih enzim restriksi yang sesuai untuk menghindari overhang 3', atau gunakan Klenow Fragment /T4 DNA polimerase untuk menyelesaikan transkripsi sebelum melanjutkan;
③Gunakan gel terdenaturasi untuk mendeteksi produk RNA.
4. Panjang transkripsi RNA kurang dari yang diharapkan
Jika elektroforesis menunjukkan pita produk lebih kecil dari ukuran yang diharapkan, kemungkinan penyebabnya adalah:
①Templat mengandung urutan terminasi yang mirip dengan RNA polimerase T7;
②Konten GC dalam templat tinggi.
Saran:
①Turunkan suhu reaksi (misalnya, 30°C). Terkadang, menurunkan suhu dapat meningkatkan panjang transkripsi, tetapi akan mengurangi hasil. Atau, cobalah berbagai RNA polimerase untuk transkripsi;
②Jika kandungan GC template tinggi, gunakan 42℃ untuk mentranskripsi, atau menambahkan SSB untuk meningkatkan hasil dan panjang transkripsi.
5. Elektroforesis tailing produk transkripsi
Terdapat fenomena tailing pada saat elektroforesis.
Kemungkinan alasan:
①Terkontaminasi oleh RNase selama operasi eksperimen;
②Cetakan DNA yang terkontaminasi oleh RNase.
Saran:
①Gunakan ujung pipet bebas RNase dan tabung EP, kenakan sarung tangan lateks dan masker sekali pakai, dan semua reagen disiapkan dengan H2O bebas RNase.
②Memurnikan kembali DNA cetakan.
[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, dkk.MikroRNA mirip RNA 8 (Nb-milR8) dari Nosema bombycis meningkatkan patogenisitas jamur dengan memodulasi ekspresi gen BmPEX16 pada inangnya, Bombyx mori. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)
[2] Wang X, Tang S, Ye S, dkk. Kuantifikasi miR-195-5p yang sangat sensitif dengan kaskade amplifikasi perpindahan tiga untai. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)
Pembayaran & Keamanan
Informasi pembayaran Anda diproses dengan aman. Kami tidak menyimpan detail kartu kredit atau memiliki akses ke informasi kartu kredit Anda.
Pertanyaan
Anda mungkin juga menyukai
FAQ
Produk ini hanya untuk keperluan penelitian dan tidak ditujukan untuk penggunaan terapeutik atau diagnostik pada manusia atau hewan. Produk dan konten dilindungi oleh paten, merek dagang, dan hak cipta milik
Aplikasi tertentu mungkin memerlukan hak kekayaan intelektual pihak ketiga tambahan.