Hieff^™ Sel Langsung Cepat Kit RT-qPCR berbasis pewarna SYBR Green cocok untuk ekstraksi RNA dari semua jenis sel hewan (seperti sel dinding garis keturunan sel dan sel suspensi, sel kultur primer, berbagai sel induk, sel iPS, dll.), tanpa perlu mengekstraksi RNA, dan dapat digunakan langsung untuk analisis ekspresi qPCR, yang singkat, mudah dioperasikan, dan memiliki tingkat kesalahan rendah. Hanya butuh 1,5 jam untuk menyelesaikan langkah-langkah dari persiapan templat hingga reaksi transkripsi balik dan analisis ekspresi gen.

Reagen transkripsi terbalik dan deteksi fluoresensi disertakan dalam kit, yang dapat digunakan untuk analisis ekspresi gen tanpa perlu membeli reagen tambahan.

Spesifikasi

Komponen

Penyimpanan

Buffer Lisis FCD dan Buffer Pencucian FCD dicairkan dan disimpan pada suhu 4°C untuk mencegah kontaminasi. FCD Stop Solution, DNase I, 4× Hifair™ FCD RT Mix, 2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix sebaiknya disimpan pada suhu -25~-15℃.

Instruksi

1. Persiapan produk pembelahan

1)1. Lelehkan reagen pada suhu ruangan, balikkan dan aduk perlahan sebelum digunakan, lalu gunakan setelah sedikit disentrifugasi untuk menghindari terbentuknya busa*.

*Kegagalan mencampur reagen, penggunaan osilator untuk pencampuran, dan kegagalan mengkonfigurasi reagen di atas es dapat menyebabkan penurunan kinerja reaksi.

2)Tergantung pada jenis sel**, pindahkan sel ke tabung sentrifus dan sentrifus pada kecepatan 5000 rpm selama 2 menit untuk mengumpulkan sel dan menyedot medium dengan baik. Jika sel dikultur dalam pelat 96-well, medium dapat disedot secara langsung.

​​​​​​​3)Tambahkan 150 μL FCD Washing Buffer ke setiap sumur, cuci sel dengan meniup, sentrifus pada 5000 rpm selama 2 menit, dan aspirasi FCD Washing Buffer***.

​​​​​​​4)Tambahkan 48 μL Larutan Buffer Lisis FCD dan 2 μL Larutan DNase I ke setiap sumur, tiup dan campur pada suhu ruangan, lalu diamkan selama 5 menit, lalu tambahkan 2.5 μL FCD Stop Solution setelah inkubasi****, lalu tiup dan campur sekitar 5 kali untuk mendapatkan produk pembelahan*****.

** Persyaratan dasar jumlah sel adalah 1 × 10⁴ sel per sumur, dan kit ini dapat digunakan dalam kisaran 1 × 10³ - 1 × 10⁶ sel. jika jumlah sel lebih besar, jumlah larutan Buffer Lisis FCD dan larutan DNaseⅠ dapat ditingkatkan secara proporsional sebagaimana mestinya.

*** Kondisi sentrifugasi bervariasi dari sel ke sel, jadi harap sentrifugasi pada kecepatan yang sesuai untuk sel yang digunakan.

**** Tambahkan 2,5 μL FCD Stop Solution ke dalam 50 μL lisat, dan tingkatkan jumlah FCD Stop Solution sesuai kebutuhan.

***** Untuk penyimpanan jangka panjang larutan produk lisis sel, letakkan pada suhu -20°C.

5）Lelehkan 4 x Campuran Hifair™ FCD RT pada suhu ruangan dan campur dengan sedikit pembalikan, letakkan di atas es dan konfigurasikan sistem reaksi sesuai dengan tabel di bawah ini:

*******Tingkat penggunaan yang disarankan adalah 2-5 μL, usahakan tidak melebihi 45%.

1. Transkripsi terbalik

Pipet dan campurkan perlahan larutan reaksi yang telah disiapkan di atas dan lakukan reaksi transkripsi balik sesuai dengan prosedur pada tabel di bawah ini:

* Suhu transkripsi balik yang disarankan adalah 55°C. Untuk templat dengan kandungan GC tinggi atau templat kompleks, suhu transkripsi balik dapat ditingkatkan hingga 60°C. Produk transkripsi balik dapat langsung digunakan untuk deteksi RT-qPCR hilir. Untuk menghindari penghambatan reaksi qPCR oleh sistem transkripsi balik dan untuk mendapatkan nilai Ct yang sesuai (10-35), produk dapat diencerkan 10-1000 kali dan kemudian digunakan. Jika eksperimen hilir tidak dilakukan dalam waktu singkat, dapat ditempatkan pada suhu -20℃ untuk penyimpanan.

1. PCR kuantitatif fluoresensi

1)Reaksi sistem konfigurasi

Rasio berikut direkomendasikan untuk persiapan larutan reaksi (persiapan di atas es).

*Jangan tambahkan lebih dari 1/10 volume RT-qPCR dari produk transkripsi balik. Konsentrasi template yang tinggi akan dengan mudah menyebabkan amplifikasi non-spesifik, pengenceran yang tepat adalah 5-50 kali. Jumlah template yang disarankan adalah 4 μL, usahakan tidak melebihi 6 μL. Jika kinerja reaksi buruk, konsentrasi primer dapat disesuaikan dalam kisaran 0,2-1,0 μmol/L.

2）Prosedur amplifikasi PCR kuantitatif fluoresensi (metode dua langkah)

3）Prosedur amplifikasi cepat untuk PCR kuantitatif fluoresensi (metode dua langkah)

* Suhu pemanasan/perpanjangan dan waktu perpanjangan akhir dapat disesuaikan dengan tepat sesuai dengan kebutuhan eksperimen. Program cepat cocok untuk sebagian besar gen, dan program standar dapat dicoba untuk masing-masing gen struktur sekunder kompleks.

Catatan

1. Produk ini hanya untuk keperluan penelitian.
2. Harap bekerja dengan jas lab dan sarung tangan sekali pakai, demi keselamatan Anda.

Versi EN20230908

Dokumen:

Buku Panduan

11172-Hieff™ Sel Cepat Langsung. EN20230908.pdf