NGS yang kuat^{Waktu Standar} OnePot Pro DNA Library Prep Kit V3 adalah kit persiapan perpustakaan berbasis fragmentasi enzimatik generasi baru dikembangkan dan dirancang khusus untuk ilumina Platform sekuensing &MGI. Dibandingkan dengan metode konstruksi perpustakaan tradisional, produk ini menggunakan enzim fragmentasi berkualitas tinggi, sehingga menghilangkan proses ultrasonik yang rumit. Produk ini menyederhanakan operasi dengan menggabungkan modul fragmentasi dan perbaikan akhir menjadi satu. Selain itu, enzim dan buffer untuk modul ligasi sudah dicampur sebelumnya, sehingga secara signifikan mengurangi waktu dan biaya konstruksi perpustakaan. Hal ini membuatnya lebih cocok untuk konstruksi perpustakaan otomatis. Kit persiapan perpustakaan ini memiliki tingkat konversi perpustakaan yang sangat baik dan berlaku untuk sampel dari semua hewan, tumbuhan, mikroorganisme umum, dll., dan juga sampel FFPE. Berdasarkan kit konstruksi perpustakaan generasi sebelumnya, produk ini menunjukkan efisiensi yang lebih tinggi dalam fragmentasi, perbaikan ujung, pengikatan dA, dan ligasi adaptor dibandingkan versi sebelumnya. Enzim dengan ketepatan tinggi secara signifikan meningkatkan keseragaman dan ketepatan amplifikasi.

Spesifikasi

Komponen

[Catatan]: Komponen kit kompatibel dengan keduanya ilumina &MGI platform sekuensing, jika adaptor lengkap telah digunakan, NGS yang kuat^{Waktu Standar} Campuran Primer (Yeasen Cat#12190 atau Cat#12191) diperlukan.

Penyimpanan

Produk ini harus disimpan pada suhu -25~-15℃ selama 1 tahun.

Catatan

1. Tentang operasi

1. Harap bekerja dengan jas lab dan sarung tangan sekali pakai，demi keselamatan Anda.

2. Cairkan komponen pada suhu ruangan. Setelah dicairkan, aduk hingga rata dengan cara dipusarkan, putar tabung sebentar dan simpan di atas es untuk digunakan kemudian.

3. Saat menyiapkan larutan reaksi untuk setiap langkah, disarankan untuk menggunakan pipet untuk mencampur dengan baik atau mengocoknya dengan lembut. Pengocokan yang kuat dapat menyebabkan penurunan hasil pustaka.

4. Sangat disarankan untuk menggunakan ujung pipet yang telah difilter untuk menghindari kontaminasi silang. Pastikan untuk mengganti ujung pipet saat memproses sampel yang berbeda.

5. Pengoperasian yang tidak tepat dapat menyebabkan kontaminasi aerosol, yang memengaruhi keakuratan hasil. Isolasi fisik wajib pada area pencampuran reaksi PCR dan area pengujian pemurnian produk PCR direkomendasikan. Dilengkapi dengan peralatan seperti pipet khusus untuk konstruksi perpustakaan. Lakukan pembersihan rutin untuk setiap area dengan mengelap permukaan dengan natrium hipoklorit 0,5% atau pemutih 10%

6. Produk ini hanya untuk keperluan penelitian.

2. Fragmentasi DNA

1. Kit ini kompatibel dengan 100 pg - 1000 ng DNA masukan. Sangat disarankan untuk menggunakan DNA masukan berkualitas tinggi dengan A260/A280 = 1,8-2,0.

2. Percobaan berikut dapat terpengaruh jika konsentrasi garam yang tinggi seperti agen khelasi logam dimasukkan bersama DNA masukan. Kami merekomendasikan untuk mengelusi sampel DNA dalam ddH₂HAI untuk fragmentasi.

3. Silakan lihat tabel 6 untuk waktu fragmentasi sampel DNA standar. Kit ini memiliki bias fragmentasi rendah dan menyediakan cakupan GC yang seragam untuk sampel DNA dengan berbagai macam komposisi GC. Harap sesuaikan waktu fragmentasi berdasarkan kebutuhan eksperimen Anda.

4. Untuk fragmentasi yang akurat, harap siapkan reaksi di atas es.

3. Ligasi Adaptor

1. Kit Adaptor Panjang Illumina atau MGI (Adaptor Berkode Batang) dan kit Adaptor pendek tersedia bagi pelanggan untuk dipilih sesuai dengan kebutuhan eksperimen mereka.

2. Disarankan untuk memilih adaptor komersial berkualitas tinggi. Jika memilih adaptor buatan sendiri, percayakan pada perusahaan yang berpengalaman dalam sintesis primer NGS dan catat perlunya pengendalian kontaminasi yang ketat. Selain itu, disarankan untuk menyiapkan larutan annealing DNA di bangku yang bersih dan hanya mengoperasikan satu jenis adaptor setiap kali untuk mencegah kontaminasi silang.

3. Harap cairkan adaptor di atas es atau pada suhu 4°C; saat beroperasi pada suhu ruangan, suhu laboratorium tidak boleh melebihi 25°C untuk mencegah adaptor mengalami denaturasi.

4. Kualitas dan konsentrasi adaptor akan secara langsung memengaruhi efisiensi ligasi dan hasil pustaka. Konsentrasi adaptor yang terlalu tinggi mendukung pembentukan dimer adaptor sementara adaptor yang terlalu sedikit mengurangi laju ligasi dan hasil pustaka. Pengenceran yang sesuai dengan Penyangga TE menurut jumlah DNA Input saat menggunakan Adaptor.Tabel 1-2 mencantumkan metode pengenceran yang direkomendasikan untuk Adaptor konvensional dan UMI untuk jumlah Input DNA yang berbeda menggunakan kit ini untuk platform sekuensing Illumina atau MGI.

Meja 1 Illumina yang direkomendasikan jumlah adaptor untuk input yang berbeda DNA

Meja 2 Yang direkomendasikan MGI jumlah adaptor untuk input yang berbeda DNA

4. Pembersihan DNA Berbasis Manik dan Pemilihan Ukuran

1. Pemilihan ukuran DNA dapat dilakukan sebelum perbaikan ujung/dA-tailing, setelah ligasi adaptor, atau setelah amplifikasi.

2. Disarankan untuk melakukan pemilihan ukuran segera setelah ligasi adaptor jika jumlah DNA masukan lebih dari 50 ng; jika tidak, silakan lakukan pemilihan ukuran setelah amplifikasi.

3. Ligation Enhancer mengandung konsentrasi PEG yang tinggi, yang dapat menyebabkan dampak signifikan pada pemilihan ukuran yang akurat. Jadi, jika pemilihan ukuran akan dilakukan tepat setelah ligasi adaptor, sangat disarankan untuk menambahkan langkah pembersihan manik-manik sebelum pemilihan ukuran. Langkah pemilihan ukuran dapat dilakukan secara langsung jika dilakukan sebelum perbaikan akhir/dA-tailing atau setelah amplifikasi perpustakaan.

4. Manik-manik magnetik harus diseimbangkan pada suhu ruangan sebelum digunakan, jika tidak, hasil akan menurun dan efek pemilihan ukuran akan terpengaruh.

5. Manik-manik magnetik harus dicampur dengan baik menggunakan pusaran atau pipet sebelum digunakan.

6. Jangan menyedot manik-manik ketika memindahkan supernatan, bahkan sejumlah kecil manik-manik dapat memengaruhi reaksi berikut.

Nomor telepon 7. Etanol 80% harus disiapkan baru, jika tidak maka akan mempengaruhi efisiensi pemulihan.

8. Untuk pemilihan ukuran yang akurat, disarankan untuk memulai dengan volume lebih dari 100 μL. Jika kurang, disarankan untuk menaikkan volume hingga 100 μL dengan air murni.

9. Manik-manik magnetik harus dikeringkan pada suhu ruangan sebelum dikeluarkan dari produk. Kekeringan yang tidak memadai akan menyebabkan residu etanol mempengaruhi reaksi selanjutnya; kekeringan yang berlebihan akan menyebabkan manik-manik magnetik retak dan mengurangi hasil pemurnian. Biasanya, pengeringan pada suhu ruangan selama 3-5 menit sudah cukup untuk memungkinkan manik-manik mengering sepenuhnya.

10. Jika diperlukan, sampel DNA yang dimurnikan atau dipilih ukurannya dielusi dalam 0,1× Buffer TE dapat disimpan pada suhu 4°C selama 1-2 minggu atau pada suhu -20°C selama sebulan.

5. Amplifikasi Perpustakaan

1. Apakah akan melakukan amplifikasi pustaka atau tidak tergantung pada jumlah masukan DNA, jenis adaptor, aplikasi data sekuensing, dll. Langkah amplifikasi diperlukan jika menggunakan adaptor parsial. Saat menggunakan adaptor dengan panjang penuh, jika DNA masukan <200 ng, disarankan untuk melakukan amplifikasi; jika tidak, amplifikasi tidak diperlukan.

2. Jumlah siklus amplifikasi harus dikontrol secara ketat. Amplifikasi yang tidak memadai dapat menyebabkan hasil pustaka yang rendah; Amplifikasi yang berlebihan dapat menyebabkan peningkatan bias, kesalahan, pembacaan terduplikasi, dan produk chimeric. Tabel 3 mencantumkan nomor siklus yang direkomendasikan yang menargetkan hasil perpustakaan sebesar 1 μg.

Meja 3 Jumlah siklus yang disarankan untuk menghasilkan 1.000 ng hasil perpustakaan

Catatan

1.Tabel 3 menunjukkan jumlah parameter loop menggunakan uji DNA Input berkualitas tinggi sekitar 200 bp. Kualitas DNA FFPE sangat bervariasi, dan ketika kualitas DNA buruk atau panjang perpustakaan panjang, jumlah siklus perlu ditingkatkan secara tepat untuk memperoleh perpustakaan yang memadai.

2.Jika pemilihan ukuran diperlukan selama proses pembangunan perpustakaan, disarankan nomor siklus yang lebih tinggi untuk Amplifikasi Perpustakaan; jika tidak, disarankan nomor siklus yang lebih rendah.

3.Jika adaptor yang digunakan tidak lengkap, setidaknya 2 siklus perlu diperkuat untuk membentuk adaptor yang lengkap.

6. Analisis Kualitas Perpustakaan

1. Kualitas perpustakaan yang dibangun umumnya dianalisis dengan mengukur konsentrasi dan distribusi ukuran.

2. Konsentrasi perpustakaan dapat diukur dengan metode berbasis fluoresensi seperti Qubit dan PicoGreen atau qPCR.

3. TIDAK disarankan untuk menggunakan metode kuantifikasi berbasis absorbansi seperti NanoDrop.

4. Disarankan untuk menggunakan metode qPCR untuk kuantifikasi pustaka: metode berbasis fluoresensi seperti Qubit dan PicoGreen tidak dapat membedakan struktur dsDNA yang tidak lengkap (sisipan tanpa adaptor atau hanya dengan satu ujung yang diligasi dengan adaptor) dari pustaka yang lengkap. Metode qPCR hanya akan mengamplifikasi dan mengukur pustaka yang lengkap dengan kedua ujung yang diligasi dengan adaptor (pustaka yang dapat diurutkan), sehingga memberikan pengukuran yang lebih akurat untuk pemuatan.

5. Distribusi ukuran perpustakaan dapat dianalisis menggunakan Agilent Bioanalyzer atau perangkat lain berdasarkan prinsip elektroforesis kapiler atau mikrofluida.

Nomor telepon 7. Bahan Lainnya

1. Manik-manik magnetik pemurnian DNA: Hieff NGS^{Waktu Standar} Manik-manik Seleksi DNA (Yeasen Cat#12601) atau AMPure^® XP Beads (A63880) atau produk setara lainnya.

2.Adaptor: Adaptor Lengkap untuk Illumina: Yeasen Cat#13519-13520; 384 Primer CDI Ganda: Yeasen Kucing#12412~Kucing#12413; 384 Primer Indeks Ganda Unik (UDI): Yeasen Kucing#12312~Kucing#12315; Adaptor UMI UDI: Yeasen Cat#13370~Cat#13371; Adaptor Lengkap untuk MGI: Yeasen Kucing#13360-13362. Campuran Primer DNA: Bahasa Indonesia:Kucing #12190 atau Kucing#12191.

3. Analisis kualitas perpustakaan: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip atau produk setara lainnya; reagen kuantitatif perpustakaan.

4. Bahan lain: etanol absolut, air ultramurni steril, ujung pipet retensi rendah, tabung PCR, dudukan magnetik, siklus termal, dll.

8. Alur kerja

Gambar 1. Alur kerja Satu Pot Pro DNA Perlengkapan Persiapan Perpustakaan

Angka

Ukuran fragmen sisipan yang diperoleh pada kondisi fragmentasi yang berbeda

Menggunakan 500 ng gDNA standar sebagai templat, pustaka dibuat dengan kit ini. Kondisi fragmentasi adalah pencernaan enzimatik pada suhu 32°C, 35°C, dan 37°C masing-masing selama 5, 10, 15, 20, dan 30 menit. Produk yang terfragmentasi dimurnikan dengan manik magnetik 1,2x dan dielusi dengan 21 μL ddH₂O. Konsentrasi diukur menggunakan Qubit, dan distribusi fragmen sisipan yang dipulihkan ditunjukkan pada gambar berikut.

Gambar 2. Profil perpustakaan pada suhu 32°C untuk waktu pencernaan enzim yang berbeda

Gambar 3. Profil perpustakaan pada suhu 35 °C untuk waktu pencernaan enzim yang berbeda

Gambar 4. Profil perpustakaan pada suhu 37 °C untuk waktu pencernaan enzim yang berbeda