Kit Persiapan Bersama Pustaka DNA&RNA Hieff NGS® V2 adalah kit ko-perpustakaan DNA&RNA untuk platform sekuensing Illumina®&MGI®, yang berisi reagen sintesis cDNA dan reagen pencernaan enzim yang efisien. Dibandingkan dengan pustaka tradisional konstruksi metode ini, produk ini dapat secara efisien menyelesaikan sintesis cDNA dan perpustakaan DNA & RNA konstruksi dalam satu tabung. Kit ini berisi enzim berkualitas tinggi untuk fragmentasi DNA dan menggabungkan fragmentasi DNA, perbaikan akhir, dan dA-tailing menjadi satu langkah, yang secara signifikan mengurangi waktu dan biaya persiapan perpustakaan. Kit persiapan pustaka ini memiliki tingkat konversi pustaka yang sangat baik dan dapat digunakan untuk sampel dari semua hewan, tumbuhan, mikroorganisme, dll., dan juga sampel FFPE. Kit yang ditingkatkan ini menggunakan ligase terbaru yang dioptimalkan yang sangat mengurangi tingkat ligasi diri selama ligasi adaptor. Selain itu, pengenalan polimerase baru dengan fidelitas tinggi semakin meningkatkan homogenitas dan fidelitas amplifikasi.

Semua komponen yang disediakan oleh kit telah menjalani kontrol kualitas dan verifikasi fungsional yang ketat, yang menjamin stabilitas dan pengulangan konstruksi perpustakaan semaksimal mungkin.

Spesifikasi

Komponen

Catatan: * menunjukkan bahwa reagen ini tidak termasuk dalam kit ini dan diperlukan reagen tambahan. Kit adalah kompatibel dengan platform ganda ilumina^®&MGI^®, tetapi campuran primer tambahan (CAT # 13334 Campuran Primer untuk MGI^® dan Cat# 13335 Campuran Primer untuk Illumina^®) diperlukan.

Alur kerja:

Penyimpanan

Produk ini harus disimpan pada suhu -25~-15℃ selama 1 tahun.

Catatan

Tentang operasi

1. 1. Demi keselamatan Anda, harap bekerja dengan jas lab dan sarung tangan sekali pakai.
2. Cairkan komponen pada suhu ruangan.Setelah dicairkan, aduk hingga rata dengan cara dipusarkan, putar tabung sebentar dan simpan di atas es untuk digunakan kemudian.
3. Disarankan untuk melakukan setiap langkah reaksi dalam termosikler dengan tutup yang dipanaskan. Termoklikler harus dipanaskan terlebih dahulu hingga mencapai suhu yang ditetapkan sebelum digunakan.
4. Harap gunakan bahan habis pakai tanpa RNasekontaminasi, dan pembersihan area percobaan secara teratur. RNAZap dari ThermoFisher^{Waktu Standar} Semprotan penghilang asam nukleat efisiensi tinggi direkomendasikan untuk menghilangkan kontaminasi RNase.
5. Pengoperasian yang tidak tepat kemungkinan besar dapat menyebabkan kontaminasi aerosol, yang memengaruhi keakuratan hasil.Disarankan untuk melakukan isolasi fisik wajib pada area pencampuran reaksi PCR dan area pengujian pemurnian produk PCR. Dilengkapi dengan peralatan seperti pipet khusus untuk konstruksi pustaka.
6. 6. Produk ini hanya untuk keperluan penelitian.

Ligasi Adaptor

1. Kit Adaptor Panjang Illumina atau MGI (Adaptor Berkode Batang) dan kit Adaptor pendek tersedia bagi pelanggan untuk dipilih sesuai dengan kebutuhan eksperimen mereka.
2. Disarankan untuk memilih adaptor komersial berkualitas tinggi. Jika memilih adaptor buatan sendiri, percayakan pada perusahaan yang berpengalaman dalam sintesis primer NGS dan catat perlunya pengendalian kontaminasi yang ketat. Selain itu, disarankan untuk menyiapkan larutan annealing DNA di bangku yang bersih dan hanya mengoperasikan satu jenis adaptor setiap kali untuk mencegah kontaminasi silang.
3. Harap cairkan adaptor di atas es atau pada suhu 4°C; saat beroperasi pada suhu ruangan, suhu laboratorium tidak boleh melebihi 25°C untuk mencegah adaptor mengalami denaturasi.
4. Konsentrasi adaptor secara langsung memengaruhi efisiensi ligasi dan hasil pustaka. Volume adaptor yang ditambahkan ke kit ditetapkan pada 5 μl. Adaptor direkomendasikan untuk diencerkan dengan buffer 0,1×TE dan adaptor yang diencerkan dapat disimpan pada suhu 4°C selama 48 jam. Tabel1 mencantumkan jumlah adaptor yang direkomendasikan untuk berbagai jumlah RNA masukan.

Tabel 1-1 Rekomendasi Illumina^® jumlah adaptor untuk input yang berbeda DNA dan RNA

Tabel 1-2 MGI yang direkomendasikan^® jumlah adaptor untuk input yang berbeda DNA dan RNA

*Penggunaan Adaptor dapat disesuaikan menurut berbagai jenis sampel Total RNA dan jumlah masukan.

Amplifikasi Perpustakaan

Jumlah siklus amplifikasi harus dikontrol secara ketat. Amplifikasi yang tidak memadai dapat menyebabkan hasil pustaka yang rendah; Amplifikasi yang berlebihan dapat menyebabkan peningkatan bias, kesalahan, pembacaan terduplikasi, dan produk chimeric. Tabel 2 mencantumkan nomor siklus yang direkomendasikan yang menargetkan hasil perpustakaan sebesar 1 μg.

Meja 2 Jumlah siklus yang disarankan untuk menghasilkan perpustakaan DNA & RNA *

Catatan: *Hasil pustaka tidak hanya terkait dengan kuantitas input dan jumlah siklus amplifikasi, tetapi juga dipengaruhi oleh kualitas sampel, kondisi fragmentasi, dan kondisi penyortiran. Dalam proses konstruksi pustaka, pilih kondisi yang paling tepat sesuai dengan situasi aktual.

Pembersihan DNA Berbasis Manik dan Pemilihan Ukuran

1. 1. Ada beberapa langkah dalam proses konstruksi perpustakaan yang memerlukan manik-manik magnetik pemurnian DNA. Kami merekomendasikan Hieff NGS™ DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601) atau manik magnetik AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) untuk pemurnian DNA dan pemilihan ukuran.
2. 2. Manik-manik magnetik harus diseimbangkan pada suhu ruangan sebelum digunakan, jika tidak, hasil akan menurun dan efek pemilihan ukuran akan terpengaruh.
3. 3. Manik-manik magnetik harus dicampur dengan baik dengan pusaran atau pipet sebelum digunakan.
4. 4. Jangan menyedot manik-manik ketika memindahkan supernatan, bahkan sejumlah kecil manik-manik dapat memengaruhi reaksi berikut.
5. 5. Etanol 80% harus disiapkan baru, jika tidak maka akan mempengaruhi efisiensi pemulihan.
6. 6.Manik-manik magnet harus dikeringkan pada suhu ruangan sebelum mengeluarkan produk. Kekeringan yang tidak memadai akan menyebabkan residu etanol mempengaruhi reaksi selanjutnya; kekeringan yang berlebihan akan menyebabkan manik-manik magnet retak dan mengurangi hasil pemurnian. Biasanya, pengeringan pada suhu ruangan selama 3-5 menit sudah cukup untuk memungkinkan manik-manik mengering sepenuhnya.
7. 7.Jika diperlukan, sampel DNA yang dimurnikan atau dipilih ukurannya dielusi dalamUkuran 1× Buffer TE dapat disimpan pada suhu 4°C selama 1-2 minggu atau pada suhu -20°C selama sebulan.

Analisis Kualitas Perpustakaan

1. Kualitas perpustakaan yang dibangun umumnya dianalisis dengan mengukur konsentrasi dan distribusi ukuran.
2. Konsentrasi perpustakaan dapat diukur dengan metode berbasis fluoresensi seperti Qubit dan PicoGreen atau qPCR.
3. TIDAK disarankan untuk menggunakan metode kuantifikasi berbasis absorbansi seperti NanoDrop.
4. Disarankan untuk menggunakan metode qPCR untuk kuantifikasi pustaka: metode berbasis fluoresensi seperti Qubit dan PicoGreen tidak dapat membedakan struktur dsDNA yang tidak lengkap (sisipan tanpa adaptor atau hanya dengan satu ujung yang diligasi dengan adaptor) dari pustaka yang lengkap. Metode qPCR hanya akan mengamplifikasi dan mengukur pustaka yang lengkap dengan kedua ujung yang diligasi dengan adaptor (pustaka yang dapat diurutkan), sehingga memberikan pengukuran yang lebih akurat untuk pemuatan.
5. Distribusi ukuran perpustakaan dapat dianalisis menggunakan Agilent Bioanalyzer atau perangkat lain berdasarkan prinsip elektroforesis kapiler atau mikrofluidika.

Bahan Lainnya

1. 1.Manik-manik magnetik pemurnian DNA: Manik-manik Seleksi DNA Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) atau AMPure^®XP Beads (A63880) atau produk setara lainnya.

2.Adaptor: Adaptor Lengkap untuk Illumina (Yeasen Cat#13519-13520 atau produk setara lainnya) atau Adaptor Lengkap untuk MGI (Yeasen Cat#13360-13362 atau produk setara lainnya).

3. Analisis kualitas perpustakaan: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip atau produk setara lainnya; reagen kuantitatif perpustakaan.
4. Bahan lain: etanol absolut, air ultramurni steril, ujung pipet retensi rendah, tabung PCR, dudukan magnetik, siklus termal, dll.

Dokumen:

Buku Panduan

12305ES-Hieff NGS® DNA&RNA Library Co-Prep Kit V2.pdf