Deskripsi Produk

Hieff NGS™ Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit merupakan kit konstruksi pustaka sekuensing RNA total untuk platform sekuensing Illumina® dan MGI®, termasuk reagen fragmentasi RNA, reagen transkripsi balik, reagen sintesis ds-cDNA konvensional dan spesifik untai, dan reagen amplifikasi pustaka. Pustaka sekuensing dapat dibangun diikuti oleh kit pemurnian mRNA atau kit penghilangan rRNA. Modul sintesis dua untai dilengkapi dengan dua penyangga untuk memenuhi kebutuhan pustaka konvensional atau pustaka spesifik untai. Di antaranya, dTTP diganti dengan dUTP dalam Penyangga sintesis dua untai spesifik untai, sehingga dUTP dapat ditambahkan ke untai kedua cDNA. DNA polimerase fidelitas tinggi yang digunakan dalam kit ini tidak dapat mengamplifikasi cetakan DNA yang mengandung urasil, sehingga mencapai spesifisitas untai. Semua reagen yang disediakan telah menjalani kontrol kualitas dan verifikasi fungsional yang ketat, memastikan stabilitas dan reproduktifitas konstruksi pustaka semaksimal mungkin.

Alur kerja

Komponen Produk

Catatan: Kit ini kompatibel dengan platform Illumina dan MGI, tetapi Illumina tambahan atau MGI Campuran Primer (Cat# 13335 Campuran Primer untuk Illumina dan Cat# 13334 Campuran Primer untuk MGI ) adalah diperlukan.

Pengiriman dan Penyimpanan

Komponen Hieff NGS™ Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit dalam Kotak I dikirimkan dengan kemasan es dan dapat disimpan pada suhu 2-8°C selama satu tahun.
Komponen Hieff NGS™ Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit dalam Kotak II dikirimkan dengan es kering dan dapat disimpan pada suhu -20°C selama satu tahun.

Perhatian

1 Operasi
1.1 Demi keselamatan dan kesehatan Anda, harap kenakan alat pelindung diri (APD), seperti jas laboratorium dan sarung tangan sekali pakai, saat menggunakan produk ini. Produk ini HANYA untuk keperluan penelitian!
1.2 Cairkan komponen pada suhu ruangan. Aduk hingga merata dengan cara dibolak-balik beberapa kali, putar sebentar, lalu taruh di atas es untuk digunakan.
1.3 Sebaiknya setiap langkah reaksi dilakukan dalam thermal cycler dengan tutup yang dipanaskan. Thermal cycler harus dipanaskan terlebih dahulu hingga mencapai suhu yang ditetapkan sebelum digunakan.
1.4 Diperlukan persediaan yang bebas dari kontaminasi RNase dan pembersihan area eksperimen secara teratur.
1.5 Pengoperasian yang tidak tepat dapat menyebabkan kontaminasi aerosol, yang memengaruhi keakuratan hasil. Isolasi fisik wajib pada daerah pencampuran reaksi PCR dan daerah pengujian pemurnian produk PCR direkomendasikan. Dilengkapi dengan peralatan seperti pipet khusus untuk konstruksi perpustakaan.
2 Ligasi Adaptor
2.1 Kit Adaptor Panjang Illumina atau MGI (Adaptor Berkode Batang) dan kit Adaptor pendek tersedia bagi pelanggan untuk dipilih sesuai dengan kebutuhan eksperimen mereka.
2.2 Disarankan untuk memilih adaptor komersial berkualitas tinggi. Jika memilih adaptor buatan sendiri, percayakan pada perusahaan yang berpengalaman dalam sintesis primer NGS dan sampaikan perlunya pengendalian kontaminasi yang ketat. Selain itu, disarankan untuk menyiapkan larutan DNA annealing di bangku yang bersih dan hanya mengoperasikan satu jenis adaptor setiap kali untuk mencegah kontaminasi silang.
2.3 Harap cairkan adaptor di atas es atau pada suhu 4°C; saat beroperasi pada suhu ruangan, suhu laboratorium tidak boleh melebihi 25°C untuk mencegah adaptor mengalami denaturasi.
2.4 Konsentrasi adaptor secara langsung memengaruhi efisiensi ligasi dan hasil pustaka. Volume adaptor yang ditambahkan ke kit ditetapkan pada 5 μl. Adaptor direkomendasikan untuk diencerkan dengan buffer 0,1×TE dan adaptor yang diencerkan dapat disimpan pada suhu 4°C selama 48 jam. Tabel 1 mencantumkan jumlah adaptor yang direkomendasikan untuk berbagai jumlah RNA masukan.

Tabel 1-1 Jumlah adaptor Illumina yang direkomendasikan untuk input RNA yang berbeda

Tabel 1-2 Jumlah adaptor MGI® yang direkomendasikan untuk input RNA yang berbeda

*Penggunaan Adaptor dapat disesuaikan menurut berbagai jenis sampel Total RNA dan jumlah masukan.

3 Amplifikasi Perpustakaan

3.1 Berdasarkan DNA polimerase generasi pertama, DNA polimerase fidelitas tinggi dalam kit telah sangat meningkatkan keseragaman amplifikasinya dan tidak menunjukkan bias amplifikasi.
3.2 Jika Adaptor Terindeks (juga dikenal sebagai adaptor panjang atau adaptor Y besar) diligasikan ke DNA target, campuran primer yang disediakan dalam kit ini dapat digunakan untuk amplifikasi; jika "adaptor pendek" atau "adaptor Y kecil" digunakan untuk ligasi DNA, primer indeks diperlukan untuk amplifikasi.
3.3 Jumlah siklus amplifikasi harus dikontrol secara ketat. Amplifikasi yang tidak mencukupi dapat menyebabkan rendahnya hasil pustaka; Amplifikasi yang berlebihan dapat menyebabkan peningkatan bias, kesalahan, pembacaan yang terduplikasi, produk chimeric, dan akumulasi mutasi ekspansi. Tabel 2 mencantumkan jumlah siklus yang direkomendasikan untuk amplifikasi PCR.

Tabel 2 Jumlah siklus yang direkomendasikan untuk menghasilkan perpustakaan RNA*

Catatan:*Hasil perpustakaan tidak hanya terkait dengan jumlah input dan jumlah siklus amplifikasi tetapi juga dipengaruhi oleh kualitas sampel, kondisi fragmentasi, dan kondisi penyortiran. Dalam proses pembangunan perpustakaan, pilih kondisi yang paling tepat sesuai dengan situasi sebenarnya.

4 Pembersihan DNA Berbasis Manik dan Pemilihan Ukuran

4.1 Ada beberapa langkah dalam proses konstruksi pustaka yang memerlukan manik-manik magnetik pemurnian DNA. Kami merekomendasikan Manik-manik Seleksi DNA Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) atau manik magnetik AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) untuk pemurnian DNA dan pemilihan ukuran.
4.2 Manik-manik magnetik harus diseimbangkan pada suhu ruangan sebelum digunakan, jika tidak, hasil akan menurun dan efek pemilihan ukuran akan terpengaruh.
4.3 Manik-manik magnetik harus dicampur dengan baik dengan pusaran atau pipet sebelum digunakan.
4.4 Jangan menyedot manik-manik ketika memindahkan supernatan, meskipun sedikit manik-manik dapat memengaruhi reaksi berikut.
4.5 Etanol 80% harus disiapkan baru, jika tidak maka akan mempengaruhi efisiensi pemulihan.
4.6 Butiran magnetik harus dikeringkan pada suhu ruangan sebelum dikeluarkan dari produk. Kekeringan yang tidak memadai akan menyebabkan residu etanol mempengaruhi reaksi selanjutnya; kekeringan yang berlebihan akan menyebabkan butiran magnetik retak dan mengurangi hasil pemurnian. Biasanya, pengeringan pada suhu ruangan selama 3-5 menit sudah cukup untuk memungkinkan butiran mengering sepenuhnya.
4.7 Jika diperlukan, sampel DNA yang dimurnikan atau dipilih ukurannya yang dielusi dalam buffer TE dapat disimpan pada suhu 4°C selama 1-2 minggu atau pada suhu -20°C selama sebulan.
5 Analisis Kualitas Perpustakaan
5.1 Biasanya, kualitas pustaka yang dibangun dapat dievaluasi berdasarkan distribusi panjang dan deteksi konsentrasi.
5.2 Deteksi konsentrasi perpustakaan: metode berdasarkan pewarna fluoresensi DNA untai ganda, seperti Qubit®, PicoGreen®, dll.; kuantifikasi absolut berdasarkan qPCR.
5.3 Metode berdasarkan deteksi spektral, seperti NanoDrop®, dll., tidak berlaku untuk deteksi konsentrasi perpustakaan.
5.4 qPCR direkomendasikan untuk deteksi konsentrasi pustaka: Melalui Qubit®, PicoGreen®, dan metode lain yang berdasarkan pewarna fluoresensi DNA untai ganda, metode ini tidak dapat secara efektif membedakan antara produk yang diligasikan ke adaptor di satu ujung, produk yang tidak diligasikan ke adaptor di kedua ujung, dan produk untai ganda yang tidak lengkap lainnya. Kuantifikasi absolut qPCR didasarkan pada prinsip amplifikasi PCR, yang hanya mengkuantifikasi pustaka lengkap adaptor di kedua ujung sampel (pustaka yang dapat diurutkan), tidak termasuk interferensi pustaka non-pengurutan yang tidak diligasikan ke adaptor di ujung tunggal atau ujung ganda.
5.5 Deteksi distribusi panjang perpustakaan dapat dilakukan oleh Agilent Bioanalyzer 2100 dan peralatan lain berdasarkan prinsip elektroforesis kapiler atau mikrofluidika.

Dokumen:

Lembar Data Keselamatan

12308-KOMPONEN A-MSDS-HB22803.pdf

12308-KOMPONEN B-MSDS-HB220803.pdf

12308-KOMPONEN C-MSDS-HB220803.pdf

12308-KOMPONEN D-MSDS-HB220803.pdf

12308-KOMPONEN E-MSDS-HB220803.pdf

12308-KOMPONEN F-MSDS-HB220803.pdf

12308-KOMPONEN G-MSDS-HB220803.pdf

12308-KOMPONEN H-MSDS-HB220803.pdf

12308-KOMPONEN I-MSDS-HB220803.pdf

12308-KOMPONEN K-MSDS-HB220803.pdf

Buku Panduan

12308ES-Hieff NGS™ Ultima Kit Persiapan Pustaka RNA Mode Ganda-Ver.EN20230327.pdf

Kutipan & Referensi:

[1] Menguraikan mikrobioma usus ikan mas rumput melalui pendekatan multi-omik
M Li, H Liang, H Yang, Q Ding, R Xia, J Chen, W Zhou… - Mikrobioma, 2024 IF:19.4

[2] Penyaringan CRISPR Gabungan Mengidentifikasi P-Bodies sebagai Represor Transisi Epitel-Mesenkim Kanker
L Fang, L Zhang, M Wang, Y He, J Yang, Z Huang… - Penelitian Kanker, 2024 IF:12.7

[3] Peptida turunan Klotho 1 menghambat penuaan sel pada ginjal fibrotik dengan memulihkan ekspresi Klotho melalui regulasi pascatranskripsi
X Zhang, L Li, H Tan, X Hong, Q Yuan, FF Hou… - Theranostics, 2024 JIKA:12.4

[4] Sel Punca Berlapis Sebagian Eksoskeleton untuk Pemulihan Miokardium yang Terkena Infark
H He, Y Yuan, Y Wu, J Lu, X Yang, K Lu… - Materi Tingkat Lanjut, 2023 JIKA: 29.4

[5] Inovasi genomik dan penataan ulang regulasi selama evolusi genus kapas Gossypium
M Wang, J Li, Z Qi, Y Long, L Pei, X Huang… - Genetika Alam, 2022 IF:41.379

[6] Alel risiko MTMR3 meningkatkan kekebalan yang diinduksi Toll Like Receptor 9 pada nefropati IgA
Y Wang, T Gan, S Qu, L Xu, Y Hu, L Liu, S Shi, J Lv… - Kidney International, 2023 IF:19.6

[7] Komplementasi terpisah dari editor dasar untuk meminimalkan suntingan yang tidak sesuai target
X Xiong, K Liu, Z Li, FN Xia, XM Ruan, X He, JF Li - Tanaman Alam, 2023 IF:18.6

[8] Vesikel membran luar bakteri rekayasa yang membungkus adenovirus onkolitik meningkatkan kemanjuran viroterapi kanker dengan meningkatkan autofagi sel tumor.
W Ban, M Sun, H Huang, W Huang, S Pan… - Komunikasi Alam, 2023 IF:16.6

[9] Resistensi Sel Kanker terhadap IFNγ Dapat Terjadi melalui Peningkatan Aktivitas Jalur Perbaikan Kerusakan Untai Ganda
T Han, X Wang, S Shi, W Zhang, J Wang, Q Wu… - Penelitian Imunologi Kanker, 2023 JIKA: 12.0

[10] Terapi kombinasi berdasarkan sistem pengiriman nano biomimetik target ganda untuk mengatasi resistensi cisplatin pada karsinoma hepatoseluler
Y Huang, Q Kou, Y Su, L Lu, X Li, H Jiang… - Jurnal Nanobioteknologi, 2023 IF: 10.9

[11] PIAS3 mempromosikan ferroptosis dengan mengatur TXNIP melalui jalur pensinyalan TGF-β pada karsinoma hepatoseluler
W Bao, J Wang, K Fan, Y Gao, J Chen - Penelitian Farmakologi, 2023 IF:9.3

[12] Identifikasi Target Protein Pengikat RNA dengan HyperTRIBE di Saccharomyces cerevisiae
W Piao, C Li, P Sun, M Yang, Y Ding, W Song… - Jurnal Internasional Ilmu Molekuler, 2023 IF:5.6

[13] Mikrobiota mengatur transisi siklus hidup dan dinamika nematosit pada ubur-ubur
S Peng, L Ye, Y Li, F Wang, T Sun, L Wang, W Hao… - Iscience, 2023 JIKA: 5.08

[14] Profil Transkriptom dan miRNA Mengungkapkan Jaringan Pengatur dan Pengatur Utama Pembentukan Xilem Sekunder pada Pohon Poplar “84K”
H Wang, P Zhao, Y He, Y Su, X Zhou… - Jurnal Internasional Ilmu Molekuler, 2023 IF:5.6