NGS yang kuat^{Waktu Standar} EvoMax RNA Library Prep Kit (dUTP) adalah sudah dicampur sebelumnya, aktinomisin D gratis dan untai khusus total Perpustakaan sekuensing RNA persiapan kit yang kompatibel dengan platform Illumina dan MGI. Produk ini tersedia dalam dua jenis: tabung atau kit penyegel, dan kit ini lebih nyaman baik dengan Perangkat Penanganan Cairan Otomatis atau manipulasi manual Kit ini berisi reagen fragmentasi RNA, reagen transkripsi balik, reagen sintesis ds-cDNA untai-spesifik, dan reagen amplifikasi pustaka. Ini dapat dihubungkan dengan kit pemurnian mRNA atau kit penghapusan rRNA untuk melakukan penelitian mRNA atau lncRNA. Produk ini mengoptimalkan modul transkripsi balik untuk memperoleh pustaka spesifisitas rantai tinggi tanpa aktinomisin D, yang menjamin keamanan para peneliti pada tingkat yang lebih tinggi. Semua reagen menjalani kontrol kualitas dan validasi fungsional yang ketat untuk memaksimalkan stabilitas dan pengulangan pustaka. persiapan.

Spesifikasi

Komponen

Catatan: * Notasi menunjukkan bahwa komponen tidak termasuk dalam kit. Campuran primer diperlukan jika adaptor lengkap digunakan, jika tidak,'Kit ini kompatibel dengan platform Illumina dan MGI, tetapi memerlukan campuran primer tambahan (Cat # 13334 Campuran Primer untuk MGI^{Waktu Standar} dan Cat # 13335 Primer Mix untuk Illumina®) untuk platform Illumina® atau MGI jika adaptor lengkap digunakan.

Angka

Tata letak kelompok reagen pelat.

Gambar 1: tata letak reagen dari kit perpustakaan pelat penyegel

Gambar 2. Komponen Sederhana dari Kit Persiapan Perpustakaan RNA EvoMax.

Penyimpanan

Produk ini harus disimpan pada suhu -25~-15℃ selama 1 bertahun-tahun.

Instruksi

1. Jumlah yang disarankan untuk ditambahkan dalam sistem 20 μL adalah 0,1-1 satuan (U), dan jumlah masukan dapat disesuaikan berdasarkan hasil aktual.

2. Sesuai dengan tuntutan percobaan, konsentrasi akhir dUTP dapat disesuaikan antara 0,2~0,6 mM, dan 0,2 mM dTTP dapat ditambahkan secara selektif.

3. Waktu reaksi pada 25~37℃ dapat disesuaikan dalam 5~10 menit sesuai dengan kebutuhan eksperimen.

Catatan

1. Operasi

1) Harap bekerja dengan jas lab dan sarung tangan sekali pakai.，untuk keselamatan anda.

2) Cairkan komponen pada suhu ruangan. Aduk hingga merata dengan cara dibolak-balik beberapa kali, putar sebentar, lalu taruh di atas es untuk digunakan.

3) Disarankan untuk melakukan setiap langkah reaksi dalam siklus termal dengan tutup yang dipanaskan. Siklus termal harus dipanaskan terlebih dahulu hingga mencapai suhu yang ditetapkan sebelum digunakan.

4) Persediaan yang bebas dari kontaminasi RNase dan pembersihan area eksperimen secara teratur diperlukan. RNAZap dari ThermoFisher^{Waktu Standar} Semprotan penghilang asam nukleat efisiensi tinggi direkomendasikan untuk menghilangkan kontaminasi RNase.

5) Pengoperasian yang tidak tepat dapat menyebabkan kontaminasi aerosol, yang memengaruhi keakuratan hasil. Isolasi fisik wajib pada daerah pencampuran reaksi PCR dan daerah pengujian pemurnian produk PCR direkomendasikan. Dilengkapi dengan peralatan seperti pipet khusus untuk konstruksi perpustakaan.

6) Reagen ini hanya untuk sekali pakai. Dilarang keras untuk menggunakannya berkali-kali.

7) Produk ini hanya untuk keperluan penelitian.

2. Ligasi Adaptor

1) Kit Adaptor Panjang Illumina atau MGI (Adaptor Berkode Batang) dan kit Adaptor pendek tersedia bagi pelanggan untuk dipilih sesuai dengan kebutuhan eksperimen mereka.

2) Disarankan untuk memilih adaptor komersial berkualitas tinggi. Jika memilih adaptor buatan sendiri, percayakan pada perusahaan yang berpengalaman dalam sintesis primer NGS dan catat perlunya pengendalian kontaminasi yang ketat. Selain itu, disarankan untuk menyiapkan larutan annealing DNA di bangku yang bersih dan hanya mengoperasikan satu jenis adaptor setiap kali untuk mencegah kontaminasi silang.

3) Harap cairkan adaptor di atas es atau pada suhu 4°C; saat beroperasi pada suhu ruangan, suhu laboratorium tidak boleh melebihi 25°C untuk mencegah adaptor mengalami denaturasi.

4) Konsentrasi adaptor secara langsung mempengaruhi efisiensi ligasi dan hasil perpustakaan. Volume adaptor yang ditambahkan ke kit ditetapkan pada 5 μl. Adaptor direkomendasikan untuk diencerkan dengan buffer 0,1×TE dan adaptor yang diencerkan dapat disimpan pada suhu 4°C selama 48 jam. Tabel 1 mencantumkan jumlah adaptor yang direkomendasikan untuk berbagai jumlah RNA masukan.

Tabel 1-1 Jumlah adaptor Illumina yang direkomendasikan untuk input RNA yang berbeda

Tabel 1-2 Jumlah adaptor MGI yang direkomendasikan untuk input RNA yang berbeda

* Penggunaan adaptor dapat disesuaikan menurut berbagai jenis sampel RNA total dan jumlah input

3.Amplifikasi Perpustakaan

1) Berdasarkan DNA polimerase generasi pertama, DNA polimerase fidelitas tinggi dalam kit telah sangat meningkatkan keseragaman amplifikasinya dan tidak menunjukkan bias amplifikasi.

2) Jumlah siklus amplifikasi harus dikontrol secara ketat. Amplifikasi yang tidak memadai dapat menyebabkan rendahnya hasil pustaka; Amplifikasi yang berlebihan dapat menyebabkan peningkatan bias, kesalahan, pembacaan yang terduplikasi, produk chimeric, dan akumulasi mutasi ekspansi. Tabel 2 mencantumkan nomor siklus yang direkomendasikan untuk amplifikasi PCR.

3) Jumlah siklus yang direkomendasikan dalam Tabel 2 dapat memenuhi sebagian besar persyaratan persiapan perpustakaan. Jika sampel Anda berkualitas buruk (seperti sampel FFPE dengan degradasi parah), jumlah siklus dapat ditingkatkan dengan tepat, sesuai dengan situasi sebenarnya. Perhatikan bahwa mRNA bervariasi dari spesies dan jaringan yang berbeda, jumlah siklus amplifikasi harus disesuaikan.

Tabel 2 Input Total volume RNA dan siklus amplifikasi yang direkomendasikan Tabel *

[Catatan]: *Hasil pustaka tidak hanya terkait dengan kuantitas input dan jumlah siklus amplifikasi, tetapi juga dipengaruhi oleh kualitas sampel, kondisi fragmentasi, dan kondisi penyortiran. Dalam proses konstruksi pustaka, pilih kondisi yang paling tepat sesuai dengan situasi aktual.

4. Pembersihan DNA Berbasis Manik dan Pemilihan Ukuran

1) Ada beberapa langkah dalam proses konstruksi pustaka yang memerlukan manik-manik magnetik pemurnian DNA. Kami merekomendasikan Hieff NGS™ DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601) atau manik magnetik AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) untuk pemurnian DNA dan pemilihan ukuran.

2) Manik magnet harus diseimbangkan ke suhu ruangan sebelum digunakan, jika tidak hasil akan menurun dan efek pemilihan ukuran akan terpengaruh.

3) Manik-manik magnetik harus dicampur dengan baik menggunakan pusaran atau pipet sebelum digunakan.

4) Jangan menyedot manik-manik ketika memindahkan supernatan, bahkan sejumlah kecil manik-manik dapat memengaruhi reaksi berikut.

5) Etanol 80% harus disiapkan baru, jika tidak maka akan mempengaruhi efisiensi pemulihan.

6) Manik-manik magnetik harus dikeringkan pada suhu ruangan sebelum dikeluarkan dari produk. Kekeringan yang tidak memadai akan menyebabkan residu etanol mempengaruhi reaksi selanjutnya; kekeringan yang berlebihan akan menyebabkan manik-manik magnetik retak dan mengurangi hasil pemurnian. Biasanya, pengeringan pada suhu ruangan selama 3-5 menit sudah cukup untuk memungkinkan manik-manik mengering sepenuhnya.

7) Jika diperlukan, sampel DNA yang dimurnikan atau dipilih ukurannya yang dielusi dalam buffer TE dapat disimpan pada suhu 4°C selama 1-2 minggu atau pada suhu -20°C selama sebulan.

5.Analisis Kualitas Perpustakaan

Secara umum, kualitas perpustakaan yang dibangun dapat dievaluasi melalui deteksi konsentrasi dan deteksi distribusi panjang.

6. Materi Lainnya

1) kit pengayaan mRNA: Kit Master Isolasi mRNA Hieff NGS® V2 (Yeasen Kucing # 12629).

2) Kit penghilangan rRNA: Kit Penghilangan rRNA Manusia Hieff NGS® MaxUp (rRNA & ITS / ETS) (Yeasen Cat # 12257) atau kit penghilangan rRNA lainnya.

3) Pemurnian RNA manik-manik magnetik: Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat # 12602) atau produk setara lainnya.

4) Manik-manik magnetik DNA yang dimurnikan: Manik-manik Seleksi DNA Hieff NGS® (Yeasen Cat # 12601) atau AMPure® XP Beads (A63880) atau produk setara lainnya.

5) Kontrol kualitas RNA: Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip atau produk setara lainnya.

6) Adaptor: Adaptor Lengkap untuk penggunaan Illumina® (Cat # 13519-13520 atau setara lainnya) atau Adaptor Lengkap untuk penggunaan MGI® (Cat # 13360-13362 atau setara lainnya).

7. Inspeksi kualitas perpustakaan

Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip / High Sensitivity Chip atau produk setara lainnya; reagen kuantifikasi perpustakaan.

8. Bahan lainnya

Etanol anhidrat, air ultramurni steril, kepala pistol adsorpsi rendah, tabung PCR, rangka magnetik, instrumen PCR, dll.

Flow chart

Gambar 1: Proses pembuatan perpustakaan RNA

Persiapan Perpustakaan RNA untuk sampel FFPE dengan kualitas berbeda

Untuk RNA FFPE yang terdegradasi parah (DV 200 <50%) dan sampel input rendah, kami merekomendasikan protokol pemurnian ganda setelah ligasi adaptor untuk mengurangi kehilangan perpustakaan.

Pola puncak dari sampel FFPE dengan kualitas berbeda