Probe Deplesi mRNA Globin (Manusia) dirancang untuk menghilangkan mRNA Globin manusia. Secara efektif dapat menghilangkan mRNA Globin dari orang dewasa, bayi, dan embriobagus sumber, termasuk HBA1/2, HBB, HBD, HBM, HBG1/2, HBE1, HBQ1 dan HBZ. Produk ini digunakan dengan Hieff NGS^{Waktu Standar} Kit Deplesi rRNA MaxUp (Manusia/Tikus/Tikus) (Yeasen#12253) untuk menghilangkan rRNA dan mRNA Globin secara efektif dari total RNA. Kit ini cocok untuk sampel RNA utuh dan terdegradasi. Sampel RNA setelah penghilangan rRNA & mRNA Globin dapat digunakan untuk analisis sekuensing mRNA dan RNA non-coding berthroughput tinggi, yang secara signifikan meningkatkan proporsi data valid dalam hasil sekuensing, dan sintesis cDNA atau aplikasi hilir lainnya.

Aplikasi Produk

Cocok untuk 100 ng~1 μg total sampel RNA manusiaBahasa Indonesia: sumber darah tikus dan mencit, dan untuk sampel RNA yang utuh atau terdegradasi sebagian.

Komponen Produk

Pengiriman dan Penyimpanan

Semua komponen dikirim dengan es kering dan dapat disimpan pada suhu -20°C selama satu tahun.

Angka

Sebanyak 500ng dan 100ng RNA total darah manusia menjalani penghilangan rRNA dan penghilangan gabungan rRNA & Globin. Setelah konstruksi dan pengurutan pustaka, kandungan mRNA Globin dibandingkan.

Perhatian

1. Harap gunakan bahan habis pakai yang bebas dari kontaminasi RNase dan bersihkan area eksperimen secara teratur. Disarankan untuk menggunakan RNAZap dari ThermoFisher^{Waktu Standar} semprotan penghilang asam nukleat efisiensi tinggi untuk menghilangkan kontaminasi RNase.

2. Sampel RNA harus bebas dari kontaminasi DNA genomik. Jika gDNA masih ada dalam sampel, sampel tersebut harus dicerna oleh DNase I dan dimurnikan sebelum digunakan.

3. Volume input maksimum sampel RNA adalah 10 μL. Jika volume sampel besar, sampel dapat dikonsentrasikan terlebih dahulu.

4. Demi keselamatan dan kesehatan Anda, harap kenakan jas lab dan sarung tangan sekali pakai selama pengoperasian.

5. Hanya untuk keperluan penelitian!

Instruksi

1. Hibridisasi Probe ke RNA

1.1 Encerkan 10 ng–1 μg total RNA dengan Air Bebas Nuklease hingga volume akhir 10 μL dalam tabung PCR. Simpan RNA di atas es.

1.2 Berkumpul reaksi hibridisasi RNA/Probe berikut di atas es sesuai dengan Tabel 1.

Tabel 1 Reaksi hibridisasi RNA/Probe

1.3 Campurkan secara menyeluruh dengan memipet perlahan ke atas dan ke bawah setidaknya 10 kali. Putar tabung sebentar dalam mikrosentrifus untuk mengumpulkan cairan dari sisi tabung.

1.4 Letakkan tabung dalam thermocycler dan jalankan program berikut pada Tabel 2 dengan tutup yang dipanaskan diatur pada suhu 105°C.

Tabel 2 Program reaksi hibridisasi RNA/Probe

2. Pencernaan RNase H

2.1 Susun reaksi pencernaan RNase H berikut ini di atas es sesuai dengan Tabel 3.

Tabel 3 Reaksi pencernaan RNase H

2.2 Campurkan secara menyeluruh dengan memipet perlahan ke atas dan ke bawah setidaknya 10 kali. Putar tabung sebentar dalam mikrosentrifus untuk mengumpulkan cairan dari sisi tabung.

2.3 Tempatkan tabung dalam thermocycler dan jalankan program berikut: tutup 50°C; 37°C, 30 menit; 4°C, tahan.

3. DNAse SAYA Pencernaan

3.1 Susun reaksi pencernaan DNase I berikut di atas es sesuai Tabel 4.

Tabel 4 Reaksi pencernaan DNase Ⅰ

3.2 Campurkan secara menyeluruh dengan memipet perlahan ke atas dan ke bawah setidaknya 10 kali. Putar tabung sebentar dalam mikrosentrifus untuk mengumpulkan cairan dari sisi tabung.

3.3 Tempatkan tabung dalam thermocycler dan jalankan program berikut: tutup; 37°C, 30 menit; 4°C, tahan.

4. Pemurnian RNA

4.1 Menyeimbangkan Hieff NGS^{Waktu Standar}RNA Cleaner (Cat#12602) hingga suhu ruangan dan suspensikan manik-manik secara menyeluruh dengan cara diaduk sebelum digunakan.

4.2 Menambahkan 110 µL (2,2×) manik-manik ke dalam larutan RNA dari Langkah 3.3 dan aduk secara menyeluruh dengan memipet ke atas dan ke bawah setidaknya 10 kali.

4.3 Inkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit untuk mengikat RNA ke manik-manik.

4.4 Letakkan tabung pada dudukan magnetik untuk memisahkan manik-manik dari supernatan. Bila larutan sudah bening (sekitar 3 menit), buang cairan supernatan. Berhati-hatilah agar tidak menyentuh butiran dengan ujung pipet.

4.5 Letakkan tabung pada dudukan magnetik. Tambahkan 200 µL etanol 80% yang baru disiapkan ke dalam tabung. Inkubasi pada suhu ruangan selama 30 detik, lalu buang cairan supernatan. Berhati-hatilah agar tidak menyentuh manik-manik dengan ujung pipet.

4.6 Ulangi Langkah 4.5 sekali untuk total dua kali pencucian.

4.7 Hapus sisa etanol dengan 10 µL - ujung pipet. Letakkan tabung pada dudukan magnetik dan angin-anginkan manik-maniknya hingga 5 menit dengan tutup terbuka.

4.8 Lepaskan tabung dari dudukan magnet. Elusi RNA dari manik-manik dengan menambahkan 11 μL Air Bebas Nuklease. Aduk rata dengan pipet ke atas dan ke bawah setidaknya 10 kali dan putar tabung sebentar.

4.9 Inkubasi selama 5 menit pada suhu ruangan. Letakkan tabung pada dudukan magnet hingga larutan menjadi bening (~3 menit).

4.10 Pindahkan 10 µL supernatan ke tabung bebas nuklease.

Catatan: Jika Anda perlu berhenti pada titik ini, sampel dapat disimpan pada suhu –80°C.