NGS yang kuat^{Waktu Standar} DNA Library Prep Kit adalah kit konstruksi perpustakaan generasi baru yang dikembangkan dan dirancang khusus untuk ilumina® &MGI® platform pengurutanBerdasarkan kit konstruksi pustaka generasi sebelumnya, produk ini menunjukkan efisiensi yang lebih tinggi dalam perbaikan ujung, pengikatan dA, dan ligasi adaptor daripada versi sebelumnya. Enzim dengan fidelitas tinggi secara signifikan meningkatkan keseragaman dan fidelitas amplifikasi. Kit ini kompatibel dengan sebagian besar jenis sampel DNA, termasuk DNA genom standar dari hewan/tanaman/mikroorganisme, sampel FFPE, cfDNA, dan DNA ChIP.

Spesifikasi

Komponen

Penyimpanan

Produk ini harus disimpan pada suhu -25~-15℃ selama 1 tahun.

Catatan

1. Tentang operasi

1Harap gunakan jas lab dan sarung tangan sekali pakai untuk keselamatan Anda.

2. Cairkan komponen pada suhu ruangan. Setelah pencairan, aduk hingga rata dengan cara dipusarkan, putar tabung sebentar dan simpan di atas es untuk digunakan kemudian.

3. Saat menyiapkan larutan reaksi untuk setiap langkah, disarankan untuk menggunakan pipet untuk mencampur dengan baik atau mengocoknya dengan lembut. Pengocokan yang kuat dapat menyebabkan penurunan hasil pustaka.

4. Sangat disarankan untuk menggunakan ujung pipet yang telah difilter untuk menghindari kontaminasi silang. Pastikan untuk mengganti ujung pipet saat memproses sampel yang berbeda.

5. Pengoperasian yang tidak tepat dapat menyebabkan kontaminasi aerosol, yang memengaruhi keakuratan hasil. Isolasi fisik wajib pada area pencampuran reaksi PCR dan area pengujian pemurnian produk PCR direkomendasikan. Dilengkapi dengan peralatan seperti pipet khusus untuk konstruksi perpustakaan.Lakukan pembersihan rutin untuk setiap area dengan menyeka permukaan dengan natrium hipoklorit 0,5% atau pemutih 10%

6Produk ini hanya untuk keperluan penelitian.

2. Fragmentasi DNA

1. Kit ini kompatibel dengan DNA yang terfragmentasi secara mekanis atau DNA yang terfragmentasi secara enzimatis.

2. Kit ini kompatibel dengan 100 pg - 1000 ng DNA input. Sangat disarankan untuk menggunakan DNA input berkualitas tinggi dengan A260/A280 = 1,8-2,0. Tabel 1 mencantumkan jumlah DNA Input yang disarankan.

Tabel 1 Jumlah Input DNA yang Direkomendasikan

Catatan: Jika DNA masukan memiliki kualitas buruk atau diperlukan pemilihan ukuran DNA, jumlah DNA masukan harus ditingkatkan sebagaimana mestinya.

3.“DNA masukan” secara khusus mengacu pada sampel DNA yang siap untuk perbaikan akhir/pengambilan tailing dA.

4. Langkah pemurnian manik-manik/pemilihan ukuran direkomendasikan pasca-fragmentasi jika sampel DNA masukan mengandung konsentrasi garam yang tinggi seperti agen khelasi logam. Garam-garam tersebut dapat memengaruhi efisiensi reaksi-reaksi berikut, termasuk perbaikan ujung dan tailing dA. Harap elusi sampel DNA dalam Buffer TE alih-alih air ultra-murni yang disterilkan untuk fragmentasi jika menggunakan metode fragmentasi mekanis. Jika menggunakan metode fragmentasi enzimatik tanpa melakukan pembersihan manik-manik atau pemilihan ukuran sebelum melanjutkan ke persiapan pustaka, harap pastikan bahwa buffer penghenti yang digunakan tidak mengandung agen khelasi logam yang berlebihan. Jika tidak, harap bersihkan atau pilih ukuran sampel yang terfragmentasi dan elusi dalam buffer TE atau air ultra-murni yang disterilkan (≤50 μL) sebelum melanjutkan ke persiapan pustaka.

3. Ligasi Adaptor

1. Kit Adaptor Panjang Illumina atau MGI (Adaptor Berkode Batang) dan kit Adaptor pendek tersedia bagi pelanggan untuk dipilih sesuai dengan kebutuhan eksperimen mereka.

2. Disarankan untuk memilih adaptor komersial berkualitas tinggi. Jika memilih adaptor buatan sendiri, percayakan pada perusahaan yang berpengalaman dalam sintesis primer NGS dan perhatikan perlunya pengendalian kontaminasi yang ketat. Selain itu, disarankan untuk menyiapkan larutan DNA annealing di bangku yang bersih dan hanya mengoperasikan satu jenis adaptor setiap kali untuk mencegah kontaminasi silang..

3. Harap cairkan adaptor di atas es atau pada suhu 4°C; saat beroperasi pada suhu ruangan, suhu laboratorium tidak boleh melebihi 25°C untuk mencegah adaptor mengalami denaturasi.

4. Kualitas dan konsentrasi adaptor akan secara langsung memengaruhi efisiensi ligasi dan hasil pustaka. Konsentrasi adaptor yang terlalu tinggi mendukung pembentukan dimer adaptor sementara adaptor yang terlalu sedikit mengurangi laju ligasi dan hasil pustaka. Pengenceran yang sesuai dengan Buffer TE menurut jumlah DNA Input saat menggunakan Adaptor.Tabel 2 -5 mencantumkan metode pengenceran Adaptor yang direkomendasikan untuk jumlah Input DNA yang berbeda menggunakan kit ini.

Meja 2 Illumina yang direkomendasikan^{Waktu Standar} jumlah adaptor untuk input yang berbeda DNA

Meja 3 MGI yang direkomendasikan^{Waktu Standar} jumlah adaptor untuk input yang berbeda DNA

Meja 4 Illumina yang direkomendasikan^{Waktu Standar} UMI jumlah adaptor untuk input yang berbeda DNA

Meja 5 MGI yang direkomendasikan^{Waktu Standar} UMI adaptor aMhitung untuk input yang berbeda DNA

4. Pembersihan DNA Berbasis Manik dan Pemilihan Ukuran

1. Pemilihan ukuran DNA dapat dilakukan sebelum perbaikan ujung/dA-tailing, setelah ligasi adaptor, atau setelah amplifikasi.

2. Disarankan untuk melakukan pemilihan ukuran segera setelah ligasi adaptor jika jumlah DNA input lebih dari 50 ngBahasa Indonesia: jika tidak, silakan lakukan pemilihan ukuran setelah amplifikasi.

3. Ligation Enhancer mengandung konsentrasi PEG yang tinggi, yang dapat menyebabkan dampak signifikan pada pemilihan ukuran yang akurat. Jadi, jika pemilihan ukuran akan dilakukan tepat setelah ligasi adaptor, sangat disarankan untuk menambahkan langkah pembersihan manik-manik sebelum pemilihan ukuran. Langkah pemilihan ukuran dapat dilakukan secara langsung jika dilakukan sebelum perbaikan akhir/dA-tailing atau setelah amplifikasi perpustakaan.

4. Manik-manik magnetik harus diseimbangkan pada suhu ruangan sebelum digunakan, jika tidak, hasil akan menurun dan efek pemilihan ukuran akan terpengaruh.

5. Manik-manik magnetik harus dicampur dengan baik menggunakan pusaran atau pipet sebelum digunakan.

6. Jangan menyedot manik-manik ketika memindahkan supernatan, bahkan sejumlah kecil manik-manik dapat memengaruhi reaksi berikut.

Nomor telepon 7. Etanol 80% harus disiapkan baru, jika tidak maka akan mempengaruhi efisiensi pemulihan.

8. Untuk pemilihan ukuran yang akurat, disarankan untuk memulai dengan volume lebih dari 100 μL. Jika kurang, disarankan untuk menaikkan volume hingga 100 μL dengan air murni.

9. Manik-manik magnetik harus dikeringkan pada suhu ruangan sebelum dikeluarkan dari produk. Kekeringan yang tidak memadai akan menyebabkan residu etanol mempengaruhi reaksi selanjutnya; kekeringan yang berlebihan akan menyebabkan manik-manik magnetik retak dan mengurangi hasil pemurnian. Biasanya, pengeringan pada suhu ruangan selama 3-5 menit sudah cukup untuk memungkinkan manik-manik mengering sepenuhnya.

10. Jika diperlukan, sampel DNA yang dimurnikan atau dipilih ukurannya dielusi dalam 0,1× Buffer TE dapat disimpan pada suhu 4°C selama 1-2 minggu atau pada suhu -20°C selama sebulan.

5. Amplifikasi Perpustakaan

1. Apakah akan melakukan amplifikasi pustaka atau tidak tergantung pada jumlah masukan DNA, jenis adaptor, aplikasi data sekuensing, dll. Langkah amplifikasi diperlukan jika menggunakan adaptor parsial. Saat menggunakan adaptor dengan panjang penuh, jika DNA masukan <200 ng, disarankan untuk melakukan amplifikasi; jika tidak, amplifikasi tidak diperlukan.

2. Jumlah siklus amplifikasi harus dikontrol secara ketat. Amplifikasi yang tidak memadai dapat menyebabkan hasil pustaka yang rendah; Amplifikasi yang berlebihan dapat menyebabkan peningkatan bias, kesalahan, pembacaan terduplikasi, dan produk chimeric. Tabel 6 mencantumkan nomor siklus yang direkomendasikan yang menargetkan hasil perpustakaan sebesar 1 μg.

Meja 6 Jumlah siklus yang disarankan untuk menghasilkan 1.000 ng hasil perpustakaan

Catatan: Bahasa Indonesia:

1.Meja 6 menunjukkan jumlah parameter loop menggunakan uji DNA Input berkualitas tinggi sekitar 200 bp. Kualitas DNA FFPE sangat bervariasi, dan ketika kualitas DNA buruk atau panjang perpustakaan panjang, jumlah siklus perlu ditingkatkan secara tepat untuk memperoleh perpustakaan yang memadai.

2.SAYAJika pemilihan ukuran diperlukan selama proses pembangunan perpustakaan, disarankan nomor siklus yang lebih tinggi untuk Amplifikasi Perpustakaan; jika tidak, disarankan nomor siklus yang lebih rendah.

3.SAYAJika adaptor yang tidak lengkap digunakan, setidaknya 2 siklus perlu diperkuat untuk membentuk adaptor yang lengkap.

6. Analisis Kualitas Perpustakaan

1. Kualitas perpustakaan yang dibangun umumnya dianalisis dengan mengukur konsentrasi dan distribusi ukuran.

2. Perpustakaan'Konsentrasi dapat diukur dengan metode berbasis fluoresensi seperti Qubit dan PicoGreen atau qPCR.

3.TIDAK disarankan untuk menggunakan metode kuantifikasi berbasis absorbansi seperti NanoDrop.

4. Disarankan untuk menggunakan metode qPCR untuk kuantifikasi pustaka: metode berbasis fluoresensi seperti Qubit dan PicoGreen tidak dapat membedakan struktur dsDNA yang tidak lengkap (sisipan tanpa adaptor atau hanya dengan satu ujung yang diligasi dengan adaptor) dari pustaka yang lengkap. Metode qPCR hanya akan mengamplifikasi dan mengukur pustaka yang lengkap dengan kedua ujung yang diligasi dengan adaptor (pustaka yang dapat diurutkan), sehingga memberikan pengukuran yang lebih akurat untuk pemuatan.

5. Distribusi ukuran perpustakaan dapat dianalisis menggunakan Agilent Bioanalyzer atau perangkat lain berdasarkan prinsip elektroforesis kapiler atau mikrofluida.

Nomor telepon 7. Bahan Lainnya

1. Manik-manik magnetik pemurnian DNA: Hieff NGS^{Waktu Standar} Manik-manik Seleksi DNA (Yeasen Cat#12601) atau AMPure^® XP Beads (A63880) atau produk setara lainnya.

2. Adaptor: Adaptor Lengkap untuk Illumina: Yeasen Kucing #13519-13520; 384 Primer CDI Ganda: Yeasen Kucing#12412~Kucing#12413Bahasa Indonesia: 384 Primer Indeks Ganda Unik (UDI): Yeasen Kucing #12312~Kucing#12315Bahasa Indonesia: Adaptor UMI UDI: Yeasen Kucing#13370~Kucing#13371; Adaptor Lengkap untuk MGI: Yeasen Kucing#13360-13362. Campuran Primer DNA:Kucing#12190 atau Kucing#12191.

3. Analisis kualitas perpustakaan: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip atau produk setara lainnya; reagen kuantitatif perpustakaan.

4. Bahan lain: etanol absolut, air ultramurni steril, ujung pipet retensi rendah, tabung PCR, dudukan magnetik, siklus termal, dll.

Instruksi

Langkah 1. Perbaikan Akhir/dA-Taling

1. Mencair reagen yang disebutkan dalam Tabel 7 Balikkan untuk mencampur reagen secara menyeluruh dan simpan di atas es untuk penggunaan selanjutnya.

2. Merakit reagen sesuai dengan Tabel 7 di atas es.

Meja 7 Sistem Perbaikan Akhir/Reaksi dA-Tailing

3. Campur perlahan dengan pipet atau pengocok, sentrifus sebentar untuk memperoleh larutan.

4. Tempatkan tabung dalam thermocycler dan atur program sesuai tabel 8.

Meja 8 Perbaikan Akhir/dA-Tailing program reaksi

Langkah 2. Ligasi Adaptor

1. Encerkan adaptor ke konsentrasi yang sesuai sesuai Tabel 2-5.

2. Mencair reagen yang disebutkan dalam Tabel 9 Balikkan untuk mencampur reagen secara menyeluruh dan simpan di atas es untuk penggunaan selanjutnya.

3. Merakit reagen sesuai dengan Tabel 9 di atas es.

Meja 9 Ligasi Adaptor ulangsistem aksi

Catatan: *Ligation Enhancer bersifat kental. Harap campurkan secara menyeluruh dengan cara dibalik atau diverteks dan sentrifus sebentar sebelum digunakan.

**Konsentrasi asli dari ilumina^{Waktu Standar} adaptor YEASE adalah 15 μM. Harap encerkan adaptor sesuai dengan jumlah input Dan buat volume adaptor tetap pada 5 μL.

**Konsentrasi asli dari MGI^{Waktu Standar} adaptor YEASE adalah 1angka 0 μM. Harap encerkan adaptor sesuai dengan jumlah input Dan buat volume adaptor tetap pada 5 μL.

4. Campurkan secara menyeluruh dengan pipet ke atas dan ke bawah secara perlahan, dan putar sebentar untuk mengumpulkan semua cairan dari sisi tabung..

5. Inkubasi sampel dalam siklus termal yang dipanaskan sebelumnya seperti yang ditunjukkan pada Tabel 10 dan melakukan reaksi koneksi adaptor.

Meja 10 Program reaksi Ligasi Adaptor

Langkah 3. Pembersihan atau Pemilihan Ukuran setelah Ligasi Adaptor

Langkah ini adalah untuk memurnikan atau memilih ukuran produk pada langkah 2 dengan manik-manik magnetik. Pemurnian dapat menghilangkan residu adaptor, dimer adaptor, atau produk lain yang tidak dapat digunakan.

BersihN naik dari DNA yang diligasikan dengan adaptor

1. Persiapan: ikuti Hieff NGS^{Waktu Standar} Keluarkan DNA Selection Beads dari lemari es, dan biarkan pada suhu ruangan selama minimal 30 menit. Siapkan etanol 80% segar.

2. Campurkan manik-manik secara menyeluruh dengan cara dibalik atau diverteks.

3. Menambahkan 88 μL NGS yang kuat^{Waktu Standar} Manik-manik Seleksi DNA (0.8×, Manik-manik: DNA = 0.8:1) ke dalam tabung yang berisi produk yang diikat adaptor, kocok dan campur rata, lalu inkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit.

4. Sentrifus sebentar untuk mendapatkan larutan, dan letakkan tabung sentrifus pada rak magnetik. Setelah butiran magnetik terserap sepenuhnya (sekitar 5 menit), keluarkan cairan dengan hati-hati.

5. Simpan tabung pada dudukan magnet, langsung tambahkan 200 μL etanol 80% yang baru disiapkan ke dalam tabung. Inkubasi pada suhu ruangan selama 30 detik dan keluarkan cairan dengan hati-hati.

6. Mengulang langkah 5 lagi.

Nomor telepon 7. Biarkan tabung pada dudukan magnetik, buka tutupnya dan keringkan manik-manik sampai manik-manik retak (tidak lebih dari 5 menit).

8. Lepaskan tabung dari dudukan magnet untuk elusi dan mengeluarkan DNA

1) Bahasa Indonesia Jika produk tidak perlu dipilih ukurannya, tambahkan 21 μL ddH₂O secara langsung. Campur secara menyeluruh dengan cara memutar atau memipet ke atas dan ke bawah sebanyak 10 kali. Inkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit. Putar tabung sebentar dan letakkan pada dudukan magnet. Saat larutan bening (sekitar 5 menit), pindahkan 20 μL supernatan ke tabung PCR baru dengan hati-hati tanpa menyentuh manik-manik magnet.

2) Jika produk perlu dipilih ukurannya, tambahkan 102 μL ddH₂O secara langsung. Campur secara menyeluruh dengan cara memutar atau memipet ke atas dan ke bawah sebanyak 10 kali. Inkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit. Putar tabung sebentar dan letakkan pada dudukan magnet. Saat larutan bening (sekitar 5 menit), pindahkan 100 μL supernatan ke tabung PCR baru dengan hati-hati tanpa menyentuh manik-manik magnet.

Catatan: Jika produk yang dimurnikan perlu disimpan, ia dapat dielusi dengan TE Buffer.

Pemilihan Ukuran DNA yang diligasikan dengan Adaptor

1.Persiapan: ikuti Hieff NGS^{Waktu Standar} Keluarkan DNA Selection Beads dari lemari es, dan biarkan pada suhu ruangan selama minimal 30 menit. Siapkan etanol 80% segar.

2. Campurkan manik-manik secara menyeluruh dengan cara dibalik atau diverteks.

3. Berdasarkan ukuran yang ditargetkan, tambahkan putaran pertama manik-manik ke 100 μL templat DNA yang dimurnikan sesuai dengan Tabel 11Aduk hingga merata dengan cara dipusingkan atau dipipet 10 kali.

Meja 11 Rasio Manik-manik:DNA yang Direkomendasikan untuk Pemilihan Ukuran Berdasarkan Manik-manik

Catatan: "×" dalam tabel menunjukkan volume sampel DNA. Misalnya, jika panjang sisipan pustaka adalah 250 bp dan volume DNA sampel adalah 100 μL, volume manik magnetik yang digunakan dalam putaran pertama penyortiran adalah 0,7×100 μL=70 μL; volume manik magnetik yang digunakan dalam putaran kedua penyortiran adalah 0,20×100 μL=20 μL. Volume manik yang direkomendasikan dalam tabel adalah untuk DNA yang diligasi dengan adaptor. Jika prosedur pemilihan ukuran dilakukan sebelum ligasi, silakan lihat protokol manufaktur Hieff NGS^{Waktu Standar} Manik-manik Seleksi DNA (Cat#12601).

4. SAYAinkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit.

5. Putar tabung sebentar dan letakkan pada dudukan magnet. Bila larutan sudah bening (sekitar 5 menit), pindahkan supernatan ke tabung PCR baru.

6. Tambahkan putaran kedua manik-manik seleksi ke sampel dari langkah 5 sesuai tabel 11.Aduk hingga merata dengan cara memutar atau memipet ke atas dan ke bawah sedikitnya 10 kali.

Nomor telepon 7. SAYAinkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit.

8. Sentrifus sebentar untuk mendapatkan larutan, dan letakkan tabung sentrifus pada rak magnetik. Setelah butiran magnetik terserap sepenuhnya (sekitar 5 menit), keluarkan cairan dengan hati-hati.

9. Simpan tabung pada dudukan magnet, langsung tambahkan 200 μL etanol 80% yang baru disiapkan ke dalam tabung. Inkubasi pada suhu ruangan selama 30 detik dan keluarkan cairan dengan hati-hati.

10. Mengulang melangkah 9 lagi.

11. Biarkan tabung pada dudukan magnetik, buka tutupnya dan keringkan manik-manik sampai manik-manik retak (tidak lebih dari 5 menit).

12. Lepaskan tabung dari dudukan magnet untuk elusi, Dan langsung tambahkan 21 μL ddH₂O. Campurkan secara menyeluruh dengan cara memutar atau memipet ke atas dan ke bawah dan inkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit. (Catatan: jika perlu menyimpan produk yang dimurnikan, harap elusi dalam Buffer TE.) Putar tabung sebentar dan letakkan di atas dudukan magnet hingga cairan menjadi bening (sekitar 5 menit). Pindahkan 20 μL supernatan dengan hati-hati ke tabung PCR baru tanpa menyentuh manik-manik.

Langkah 4 Amplifikasi Perpustakaan

Langkah ini dapat memperkaya produk yang dimurnikan atau dipilih ukurannya melalui amplifikasi PCR.

1. Cairkan daftar reagen dalam tabel 12, balikkan dan aduk hingga rata, lalu simpan di atas es untuk digunakan kemudian.

2. Rakit reaksi berikut dalam tabung PCR yang disterilkan.

Meja 12 reaksi PCR DNA yang diligasi dengan adaptor sistem

[Catatan]: * jika adaptor lengkap digunakan, NGS yang kuat^{Waktu Standar} Campuran Primer (Yeasen Kucing #12190 atau Cat#12191) dibutuhkan; Jika adaptor yang digunakan tidak lengkap (Cat#12412~Cat#12413, Cat#12312~Kucing#12315, Cat#13370~Cat#13371), silakan lihat petunjuk kit dan gunakan Indeks Primer yang disediakan dalam kit untuk amplifikasi.

3. Campurkan perlahan dengan pipet atau pengocok, dan sentrifus sebentar untuk memperoleh larutan.

4. Masukkan tabung ke dalam thermocycler dan atur program sesuai tabel 13 untuk memulai amplifikasi.

Meja 13 Program reaksi amplifikasi PCR

Langkah 5 Pembersihan Pasca-Amplifikasi/Pemilihan Ukuran

Yang bersih naik tangga mengacu pada melangkah 3. NGS yang kuat^{Waktu Standar} DNA Selection Beads (0.9×, Beads:DNA=0.9:1) digunakan untuk memurnikan produk PCR. Jika diperlukan pemilihan ukuran, silakan lihat melangkah 3.

Langkah 6 Kontrol Kualitas Perpustakaan Akhir

Kualitas perpustakaan yang dibangun umumnya dievaluasi dengan mengukur konsentrasi dan distribusi ukuran. Untuk rinciannya, silakan lihat Catatan 6.