NGS Hieff™ adalah OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 adalah kit persiapan perpustakaan enzimatik generasi berikutnya yang dirancang untuk digunakan dengan Illumina dan platform sekuensing berthroughput tinggi MGI. Dibandingkan dengan metode penyiapan pustaka tradisional, kit ini menggunakan enzim fragmentasi berkualitas tinggi, sehingga menghilangkan kebutuhan akan proses sonikasi yang rumit. Modul fragmentasi dan perbaikan akhir digabungkan menjadi satu langkah, sehingga secara signifikan mengurangi waktu dan biaya penyiapan pustaka. Kit ini cocok untuk berbagai jenis sampel, termasuk genom tumbuhan dan hewan, genom mikroba, dan lainnya, dengan rentang masukan sampel 1 ng hingga 1 μg. Fragmentasi enzimatik memastikan ukuran fragmen yang seragam di berbagai spesies, dengan variasi antarspesies yang minimal. Selain itu, kit ini dapat dipasangkan dengan Illumina atau MGI adaptor dan primer untuk pengurutan pada platform berthroughput tinggi Illumina atau MGI.

Spesifikasi

Komponen

Penyimpanan

Produk ini harus disimpan pada suhu -25~-15℃ selama 1 tahun.

Catatan

1. Tentang operasi

1. Harap bekerja dengan jas lab dan sarung tangan sekali pakai，demi keselamatan Anda.

2. Cairkan komponen pada suhu ruangan. Setelah pencairan, aduk hingga rata dengan cara dipusarkan, putar tabung sebentar dan simpan di atas es untuk digunakan kemudian.

3. Saat menyiapkan larutan reaksi untuk setiap langkah, disarankan untuk menggunakan pipet untuk mencampur dengan baik atau mengocoknya dengan lembut. Pengocokan yang kuat dapat menyebabkan penurunan hasil pustaka.

4. Sangat disarankan untuk menggunakan ujung pipet yang telah difilter untuk menghindari kontaminasi silang. Pastikan untuk mengganti ujung pipet saat memproses sampel yang berbeda.

5. Pengoperasian yang tidak tepat dapat menyebabkan kontaminasi aerosol, yang memengaruhi keakuratan hasil. Isolasi fisik wajib pada area pencampuran reaksi PCR dan area pengujian pemurnian produk PCR direkomendasikan. Dilengkapi dengan peralatan seperti pipet khusus untuk konstruksi perpustakaan.Lakukan pembersihan rutin untuk setiap area dengan menyeka permukaan dengan natrium hipoklorit 0,5% atau pemutih 10%

6. Produk ini hanya untuk keperluan penelitian.

1. Kit ini kompatibel dengan 100 pg - 1000 ng DNA masukan. Sangat disarankan untuk menggunakan DNA masukan berkualitas tinggi dengan A260/A280 = 1,8-2,0.

2. Percobaan berikut dapat terpengaruh jika konsentrasi garam yang tinggi seperti agen khelasi logam dimasukkan bersama DNA masukan. Kami merekomendasikan untuk mengelusi sampel DNA dalam ddH₂HAI untuk fragmentasi.

3. Silakan lihat tabel 6 untuk waktu fragmentasi sampel DNA standar.Kit ini memiliki bias fragmentasi rendah dan menyediakan cakupan GC yang seragam untuk sampel DNA dengan berbagai komposisi GC. Harap sesuaikan waktu fragmentasi berdasarkan kebutuhan eksperimen Anda.

4. Untuk fragmentasi yang akurat, harap siapkan reaksi di atas es.

3. Ligasi Adaptor

1. Kit Adaptor Panjang Illumina atau MGI (Adaptor Berkode Batang) dan kit Adaptor pendek tersedia bagi pelanggan untuk dipilih sesuai dengan kebutuhan eksperimen mereka.

2. Disarankan untuk memilih adaptor komersial berkualitas tinggi. Jika memilih adaptor buatan sendiri, percayakan pada perusahaan yang berpengalaman dalam sintesis primer NGS dan catat perlunya pengendalian kontaminasi yang ketat. Selain itu, disarankan untuk menyiapkan larutan annealing DNA di bangku yang bersih dan hanya mengoperasikan satu jenis adaptor setiap kali untuk mencegah kontaminasi silang.

3. Harap cairkan adaptor di atas es atau pada suhu 4°C; saat beroperasi pada suhu ruangan, suhu laboratorium tidak boleh melebihi 25°C untuk mencegah adaptor mengalami denaturasi.

4. Kualitas dan konsentrasi adaptor akan secara langsung memengaruhi efisiensi ligasi dan hasil pustaka. Konsentrasi adaptor yang terlalu tinggi mendukung pembentukan dimer adaptor sementara adaptor yang terlalu sedikit mengurangi laju ligasi dan hasil pustaka. Pengenceran yang sesuai dengan Buffer TE menurut jumlah DNA Input saat menggunakan Adaptor.Tabel 2 -3 mencantumkan metode pengenceran Adaptor yang direkomendasikan untuk jumlah Input DNA yang berbeda menggunakan kit ini.

Tabel 1 Jumlah adaptor Illumina yang direkomendasikan untuk input DNA yang berbeda

Tabel 2 Jumlah adaptor MGI yang direkomendasikan untuk input DNA yang berbeda

4. Pembersihan DNA Berbasis Manik dan Pemilihan Ukuran

1. Langkah pemilihan ukuran fragmen DNA dapat dilakukan setelah ligasi adaptor atau setelah amplifikasi perpustakaan.

2. Disarankan untuk melakukan pemilihan ukuran segera setelah ligasi adaptor jika jumlah DNA input lebih dari 50 ngBahasa Indonesia: jika tidak, silakan lakukan pemilihan ukuran setelah amplifikasi.

3. Ligation Enhancer mengandung konsentrasi PEG yang tinggi, yang dapat menyebabkan dampak signifikan pada pemilihan ukuran yang akurat. Jadi, jika pemilihan ukuran akan dilakukan tepat setelah ligasi adaptor, sangat disarankan untuk menambahkan langkah pembersihan manik-manik sebelum pemilihan ukuran. Langkah pemilihan ukuran dapat dilakukan secara langsung jika dilakukan sebelum perbaikan akhir/dA-tailing atau setelah amplifikasi perpustakaan.

4. Manik-manik magnetik harus diseimbangkan pada suhu ruangan sebelum digunakan, jika tidak, hasil akan menurun dan efek pemilihan ukuran akan terpengaruh.

5. Manik-manik magnetik harus dicampur dengan baik menggunakan pusaran atau pipet sebelum digunakan.

6. Jangan menyedot manik-manik ketika memindahkan supernatan, bahkan sejumlah kecil manik-manik dapat memengaruhi reaksi berikut.

Nomor telepon 7. Etanol 80% harus disiapkan baru, jika tidak maka akan mempengaruhi efisiensi pemulihan.

8. Untuk pemilihan ukuran yang akurat, disarankan untuk memulai dengan volume lebih dari 100 μL. Jika kurang, disarankan untuk menaikkan volume hingga 100 μL dengan air murni.

9. Manik-manik magnetik harus dikeringkan pada suhu ruangan sebelum dikeluarkan dari produk. Kekeringan yang tidak memadai akan menyebabkan residu etanol mempengaruhi reaksi selanjutnya; kekeringan yang berlebihan akan menyebabkan manik-manik magnetik retak dan mengurangi hasil pemurnian. Biasanya, pengeringan pada suhu ruangan selama 3-5 menit sudah cukup untuk memungkinkan manik-manik mengering sepenuhnya.

10. Jika diperlukan, sampel DNA yang dimurnikan atau dipilih ukurannya dielusi dalam 0,1× Buffer TE dapat disimpan pada suhu 4°C selama 1-2 minggu atau pada suhu -20°C selama sebulan.

5. Amplifikasi Perpustakaan

1. Apakah akan melakukan amplifikasi pustaka atau tidak tergantung pada jumlah masukan DNA, jenis adaptor, aplikasi data sekuensing, dll. Langkah amplifikasi diperlukan jika menggunakan adaptor parsial. Saat menggunakan adaptor dengan panjang penuh, jika DNA masukan <200 ng, disarankan untuk melakukan amplifikasi; jika tidak, amplifikasi tidak diperlukan.

2. Jumlah siklus amplifikasi harus dikontrol secara ketat. Amplifikasi yang tidak memadai dapat menyebabkan hasil pustaka yang rendah; Amplifikasi yang berlebihan dapat menyebabkan peningkatan bias, kesalahan, pembacaan terduplikasi, dan produk chimeric. Tabel 3 mencantumkan nomor siklus yang direkomendasikan yang menargetkan hasil perpustakaan sebesar 1 μg.

Tabel 3 Jumlah siklus yang direkomendasikan untuk menghasilkan 1.000 ng hasil perpustakaan

Catatan: Bahasa Indonesia:

1.Tabel 3 menunjukkan jumlah parameter loop menggunakan uji DNA Input berkualitas tinggi sekitar 200 bp. Kualitas DNA FFPE sangat bervariasi, dan ketika kualitas DNA buruk atau panjang perpustakaan panjang, jumlah siklus perlu ditingkatkan secara tepat untuk memperoleh perpustakaan yang memadai.

2.SAYAJika pemilihan ukuran diperlukan selama proses pembangunan perpustakaan, disarankan nomor siklus yang lebih tinggi untuk Amplifikasi Perpustakaan; jika tidak, disarankan nomor siklus yang lebih rendah.

3.SAYAJika adaptor yang tidak lengkap digunakan, setidaknya 2 siklus perlu diperkuat untuk membentuk adaptor yang lengkap.

6. Analisis Kualitas Perpustakaan

1. Kualitas perpustakaan yang dibangun umumnya dianalisis dengan mengukur konsentrasi dan distribusi ukuran.

2. Konsentrasi perpustakaan dapat diukur dengan metode berbasis fluoresensi seperti Qubit dan PicoGreen atau qPCR.

3. TIDAK disarankan untuk menggunakan metode kuantifikasi berbasis absorbansi seperti NanoDrop.

4. Disarankan untuk menggunakan metode qPCR untuk kuantifikasi pustaka: metode berbasis fluoresensi seperti Qubit dan PicoGreen tidak dapat membedakan struktur dsDNA yang tidak lengkap (sisipan tanpa adaptor atau hanya dengan satu ujung yang diligasi dengan adaptor) dari pustaka yang lengkap. Metode qPCR hanya akan mengamplifikasi dan mengukur pustaka yang lengkap dengan kedua ujung yang diligasi dengan adaptor (pustaka yang dapat diurutkan), sehingga memberikan pengukuran yang lebih akurat untuk pemuatan.

5. Distribusi ukuran perpustakaan dapat dianalisis menggunakan Agilent Bioanalyzer atau perangkat lain berdasarkan prinsip elektroforesis kapiler atau mikrofluida.

7. Bahan Lainnya

1. Manik-manik magnetik pemurnian DNA: Hieff NGS^{Waktu Standar} Manik-manik Seleksi DNA (Yeasen Cat#12601) atau AMPure^® XP Beads (A63880) atau produk setara lainnya.

2. Adaptor: Adaptor Lengkap untuk Illumina: Yeasen Kucing #13519-13520; 384 Primer CDI Ganda: Yeasen Kucing#12412~Kucing#12413Bahasa Indonesia: 384 Primer Indeks Ganda Unik (UDI): Yeasen Kucing #1tahun 2327~Kucing #13330Bahasa Indonesia: Adaptor UMI UDI: Yeasen Kucing#13370~Kucing#13371; Adaptor Lengkap untuk MGI: Yeasen Cat#13360-13362. Campuran Primer DNA: Bahasa Indonesia:Kucing#12190 atau Kucing#12191.

3. Analisis kualitas perpustakaan: Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip atau produk setara lainnya; reagen kuantitatif perpustakaan.

4. Bahan lain: etanol absolut, air ultramurni steril, ujung pipet retensi rendah, tabung PCR, dudukan magnetik, siklus termal, dll.

8. Alur kerja

Gambar 1.Alur kerja dari Satu Pot Pro DNA Perlengkapan Persiapan Perpustakaan