Instruksi

1. Persiapan sebelum percobaan

1) Siapkan reagen dan bahan yang diperlukan yang akan digunakan dalam percobaan.

2）Konfirmasi kesesuaian instrumen qPCR

Kit ini dapat digunakan pada jenis instrumen qPCR seperti di bawah ini:

1. Bio-Rad: CFX96
2. Thermo Scientific: Sistem PCR Real-Time 7500；QuantStudio™5；
3. Metode percobaan

1) Ekstraksi DNA

Kami merekomendasikan untuk menggunakan ' Kit Persiapan Sampel DNA Residu Magnetik (Cat#18461ES untuk ekstraksi manual dan Cat#18462ES untuk ekstraksi otomatis) untuk ekstraksi DNA, Anda Bisa mengunjungi ' http://www.yeasenbiotech.com '  untuk itu

informasi terperinci dan pembelian.

Kit (Cat#40619ES) berisi kontrol internal (IC). Jika menambahkan IC ke sampel sebelum ekstraksi DNA, maka dapat memverifikasi proses lengkap (termasuk ekstraksi DNA dan reaksi qPCR). Jika menambahkan IC ke campuran induk qPCR

secara langsung, IC akan bertindak sebagai kontrol qPCR saja.

2）Persiapan Campuran qPCR

1. Berdasarkan jumlah sampel yang meliputi Kontrol Positif (PCS), Kontrol Tanpa Template (NTC), Kontrol Negatif  larutan kontrol (NCS) dan sampel uji (TS) untuk menghitung jumlah reaksi. Siapkan 2 reaksi secara paralel untuk

setiap sampel secara umum.

* PCS: Positif kontrol solusi；NTC：Tidak templat kontrol；NCS：Negatif kontrol solusi；TS：Uji contoh. Ada adalah TIDAK membutuhkan ke melakukan

itu mencicipi ekstraksi untuk komputer Dan NTC, tapi Bahasa Indonesia: NCS Dan TS adalah diperlukan.

Sumur reaksi (M1) = (1 × NCS + (N×TS) ×2

Sumur reaksi (M2) = (1 × PCS + 1 × NTC) ×2

Sumur reaksi (M3) = (1 × PCS + 1 × NTC + N × TS) ×2

1. Cairkan terlebih dahulu jumlah reagen yang diperlukan dalam es sesuai dengan desain percobaan dan Tabel di bawah ini.
2. Hitung jumlah qPCR Mix sesuai dengan Jumlah reaksi. Perlu diperhatikan, jika kit akan digunakan untuk kegiatan GMP seperti pelepasan produk, kami sarankan menggunakan Tabel 1 dan 2 untuk persiapan; Jika perlengkapan akan hanya digunakan untuk penelitian dan tidak perlu menambahkan IC sebelum ekstraksi setelah evaluasi, maka ikuti Tabel 3 untuk

persiapan. Harap dicatat bahwa tidak semua M1, M2 dan M3 adalah dibutuhkan untuk menjadi mempersiapkan.

Tabel 1 Sistem Campuran qPCR untuk M1

*Itu konfigurasi sistem di dalam Meja 1 adalah berdasarkan pada itu premis itu IC adalah ditambahkan sebelum ekstraksi untuk keduanya Bahasa Indonesia: NCS Dan TS, jadi dia adalah bukan diperlukan

ke menambahkan IC Kapan qPCR Mencampur persiapan. IC menambahkan metode sebelum ekstraksi: Pertama, encerkan IC oleh 20 kali dengan DNA pengencer, dan menambahkan 1 mikroliter

diencerkan IC ke dalam setiap 100 mikroliter tes mencicipi untuk itu lebih jauh ekstraksi.

**Ini perlengkapan melakukan bukan berisi BATU Referensi Pewarna. Jika BATU referensi pewarna adalah diperlukan untuk itu Nyata Waktu PCR penguat itu Anda adalah saat ini menggunakan, 50×ROX Referensi Pewarna (Cat#10200ES) adalah direkomendasikan untuk menggunakan. Di dalam ini kasus, ditambahkan volume adalah 0,8μL, sebagai ditampilkan di dalam Meja 1. Jika menggunakan lainnya

Merek dari BATU produk, silahkan merujuk ke milik mereka instruksi untuk BATU tambahan.Jika TIDAK BATU referensi pewarna adalah dibutuhkan, ditambahkan volume adalah angka 0 Jumlah halaman

Tabel 2 Sistem Campuran qPCR untuk M2

*Itu konfigurasi sistem di dalam Meja 2 adalah berdasarkan pada itu premis itu IC adalah bukan ditambahkan di dalam komputer Dan NTC sebelum ekstraksi, Jadi IC kebutuhan ke menjadi ditambahkan selama qPCR Mencampur persiapan. IC menambahkan metode setelah ekstraksi: Mencairkan IC oleh 100 kali dengan DNA pengencer Dan menambahkan 1 mikroliter diencerkan IC ke dalam

setiap qPCR Mencampur sistem.

**Ini perlengkapan melakukan bukan berisi BATU Referensi Pewarna. Jika BATU referensi pewarna adalah diperlukan untuk itu Nyata Waktu PCR penguat itu Anda adalah saat ini menggunakan, 50×ROX Referensi Pewarna (Cat#10200ES) adalah direkomendasikan untuk menggunakan. Di dalam ini kasus, ditambahkan volume adalah 0,8μL, sebagai ditampilkan di dalam Meja 1. Jika menggunakan lainnya

Merek dari BATU produk, silahkan merujuk ke milik mereka instruksi untuk BATU tambahan. Jika TIDAK BATU referensi pewarna adalah dibutuhkan, ditambahkan volume adalah angka 0 Jumlah halaman

Tabel 3 Sistem Campuran qPCR untuk M3

*Itu konfigurasi sistem di dalam Meja 3 adalah berdasarkan pada itu premis itu IC adalah bukan ditambahkan ke sampel sebelum ekstraksi, jadi IC kebutuhan ke menjadi ditambahkan    selama qPCR Mencampur persiapan. IC menambahkan metode setelah ekstraksi: Mencairkan IC oleh 100 kali dengan DNA pengencer Dan menambahkan 1 mikroliter ke dalam setiap qPCR Mencampur

sistem.

**Ini perlengkapan melakukan bukan berisi BATU Referensi Pewarna. Jika BATU referensi pewarna adalah diperlukan untuk itu Nyata Waktu PCR penguat itu Anda adalah saat ini menggunakan, 50×ROX Referensi Pewarna (Cat#10200ES) adalah direkomendasikan untuk menggunakan. Di dalam ini kasus, ditambahkan volume adalah 0,8μL, sebagai ditampilkan di dalam Meja 1. Jika menggunakan lainnya

Merek dari BATU produk, silahkan merujuk ke milik mereka instruksi untuk BATU tambahan. Jika TIDAK BATU referensi pewarna adalah dibutuhkan, ditambahkan volume adalah angka 0 Jumlah halaman

3）Menambahkan template

1. Campur qPCR Mix dengan pengocokan yang cukup, sentrifus dengan kecepatan rendah dan kumpulkan sisa cairan dari tutupnya

sampai ke dasar tabung.

1. Tambahkan 20 μL qPCR Mix ke dalam setiap tabung reaksi/sumur. Harap perhatikan penambahan qPCR Mix yang sesuai ke dalam setiap tabung reaksi.

tabung sampel dan menghindari penambahan kesalahan.

1. TambahkanTemplate ke tabung/sumur yang berisi Campuran qPCR. Lihat Tabel 4 untuk penambahan template.

Meja 4 Template menambahkan

*Kami menyarankan untuk menggunakan buffer Pengenceran DNA (40619-E) sebagai templat NCS untuk ekstraksi DNA.

**Itu total reaksi volume di dalam setiap tabung/sumur adalah 40 Jumlah halaman

***Menutupi itu tabung tutup atau itu piring film. Untuk menghindari mempengaruhi itu fluoresensi sinyal tolong baca mengambil peduli bukan ke tanda itu tabung tutup atau film

atau bahkan menggosok itu film berulang-kali dengan A pengikis.

****Sentrifus itu reaksi tabung atau piring secara singkat pada rendah kecepatan setelah templat menambahkan. Setelah memadai goncangan Dan mencampur, mengulang mesin sentrifus

pada rendah kecepatan ke mengumpulkan itu cairan dari itu tutup atau dinding ke itu bawah. Hindari gelembung Kapan operasi. garis dasar akan menjadi terkena dampak jika itu mencampur

adalah bukan campur aduk baiklah, jadi ini melangkah adalah sangat penting ke A Bagus percobaan hasil.

4）Pengaturan program qPCR

1. Pengaturan file program

Contoh (instrumen Sistem PCR Real-Time 7500 dan Perangkat Lunak PCR Real-Time v2.4):

Tipe instrumen: 7500 (96 Sumur)

Jenis percobaan：Kuantisasi-Kurva Standar；

Kimia：Reagen Taqman®

Kecepatan Ramp：Standar (~2 jam untuk menyelesaikan lari)

1. Pengaturan saluran target

Di dalam "Mendefinisikan Sasaran Dan Sampel" dari "Piring Pengaturan", membuat A Target 1 saluran (KELUARGA), memilih KELUARGA sebagai itu pelaporan kelompok fluoresensi dan MGB atau tidak ada sebagai pendinginan fluoresensi kelompok. Membuat A Target 2 saluran (KOTA), memilih itu pelaporan fluoresensi kelompok sebagai VIC Dan itu memadamkan fluoresensi kelompok sebagai tidak ada. Di dalam "Menetapkan Sasaran Dan Sampel" dari "Piring Pengaturan", jika TIDAK tambahan BATU pewarna adalah ditambahkan, pilih "tidak ada"; Jika sebuah tambahan BATU adalah ditambahkan, pilih

ROX.

1. Pengaturan program amplifikasi standar

Tabel 5 Pengaturan program amplifikasi standar

1. Penetapan batas dasar dan ambang batas:

Prinsip dari garis dasar pengaturan: menggunakan itu otomatis garis dasar umumnya. Jika membutuhkan ke menyesuaikan di dalam buku petunjuk, memilih itu siklus sebelum pertumbuhan eksponensial periode sebagai siklus awal, dan menghindari zona fluktuasi awal fluoresensi koleksi. Pilih siklus yang 1-2 siklus sebelum Ct dari sampel amplifikasi eksponensial paling awal sebagai

titik akhir.

Prinsip dari ambang penyesuaian: umumnya menggunakan ambang batas otomatis. Jika perlu penyesuaian manual, ambang batas sebaiknya menjadi mengatur lebih tinggi dibandingkan itu Negatif mencicipi atau itu garis dasar kebisingan, dia umumnya mengatur ambang batas di dalam itu terlambat

tahap amplifikasi eksponensial, ambang batas yang relatif independen dan sesuai diperlukan untuk setiap terowongan.

5) Hasil Analisa

1. Hasil penilaian untuk PCS, NTC dan NCS:

Jika IC ditambahkan: spesifikasi setiap sampel kontrol harus puas pada Tabel 6:

Meja 6 Hasil keputusan dari PCS, NTC Dan Bahasa Indonesia: NCS

Jika IC tidak ditambahkan: setiap sampel kontrol kualitas harus memenuhi spesifikasi kolom sinyal FAM pada Tabel 6, dan tidak ada

perlu menganalisis saluran VIC.

1. Hasil penilaian untuk TS

Prasyarat: Dia adalah perlu untuk menentukan apakah komputer, NTC dan Bahasa Indonesia: NCS lulus spesifikasi di Tabel 6 sebelum TS analisis hasil. Jika lolos maka bisa Lanjutkan ke langkah berikutnya. Jika tidak lulus, itu TS hasil mungkin bukan menjadi dapat diandalkan, Dan

alasannya perlu diselidiki.

Jika IC ditambahkan: temukan hasil yang sesuai penilaian berdasarkan informasi hasil FAM dan VIC pada Tabel 7:

Meja 7: Hasil keputusan dari TS (IC (ditambahkan)

*Jika di sana adalah inhibisi untuk VIC sinyal,pengobatan adalah diperlukan ke menghapuskan itu penghambat atau mengulang itu tes.

Jika IC tidak ditambahkan: temukan hasil yang sesuai penghakiman menurut informasi hasil FAM pada Tabel 8 , dan tidak perlu menganalisisnya Sinyal VIC.

Meja 8: Hasil keputusan dari TS (IC bukan (ditambahkan)

Catatan

1. Harap baca manual ini dengan saksama sebelum menggunakan kit ini. Percobaan harus dilakukan dengan cara yang terstandarisasi, termasuk penanganan sampel, persiapan sistem reaksi, dan penambahan sampel.

2. Jika memungkinkan, simpan operasi penambahan sampel dan persiapan reagen di atas es.
3. Kocok dan campurkan rata setiap reagen sebelum digunakan.

4. Harap operasikan dengan jas lab dan sarung tangan sekali pakai, untuk keselamatan Anda.
5. Produk ini hanya untuk keperluan penelitian.