Polibrena (heksadimetrin bromida), juga dikenal sebagai Polibrena, adalah polimer kationik yang umum digunakan dalam eksperimen transfeksi DNA dengan sel mamalia untuk meningkatkan efisiensi transfeksi liposom. Polibrena banyak digunakan dalam transfeksi gen yang dimediasi retrovirus dan transfeksi gen yang dimediasi lentivirus. Mekanisme kerjanya mungkin melibatkan penetralan asam sialik pada permukaan sel, memfasilitasi penyerapan dengan mengatasi tolakan elektrostatik dengan partikel virus. Polibrena juga dikenal sebagai antikoagulan (antagonis heparin) dan sering digunakan dalam produksi sel darah merah yang teragregasi secara non-spesifik. Selain itu, dalam pengurutan protein, dosis rendah Polibrena telah terbukti secara signifikan meningkatkan degradasi peptida dalam analisis pengurutan otomatis. Penambahan Polibrena ke membran PVDF juga dapat meningkatkan afinitas membran.

Spesifikasi

Produk ini tersedia dalam bentuk larutan, dan bubuknya dilarutkan kembali dalam 0,9% NaCl untuk membuat larutan 10 mg/mL, yang kemudian disterilkan menggunakan filter 0,22 μm. Biasanya diencerkan dengan rasio 1:1000-1:2000 untuk penggunaan, dengan rasio pengenceran tertentu tergantung pada jenis sel, sebagaimana diuraikan dalam literatur terkait.

Pengiriman dan Penyimpanan

Pengangkutan dan penyimpanan direkomendasikan pada suhu -20 ºC, dengan masa simpan 2 tahun. Disarankan untuk memisahkan dan menyimpan untuk menghindari siklus beku-cair yang berulang.

Tindakan pencegahan:

1. Kenakan pakaian laboratorium dan sarung tangan sekali pakai untuk keselamatan dan kesehatan.

2. Produk ini hanya untuk tujuan penelitian.

Langkah-langkah operasional

(untuk referensi, konsentrasi spesifik dapat bervariasi, lihat literatur yang relevan):

Catatan: Polybrene dapat menunjukkan toksisitas yang signifikan terhadap sel-sel tertentu (seperti neuron yang berdiferensiasi secara terminal, sel DC), dan uji toksisitas direkomendasikan untuk penggunaan awal.

Percobaan 1: Infeksi Retrovirus

1. Persiapan stok retrovirus rekombinan: Kultur sel yang mengandung satu lapis sel pengemasan retrovirus transfeksi dalam cawan berukuran 100 mm dengan 5 mL media pertumbuhan (5% serum). Setelah 24 jam, keluarkan media kultur dan saring melalui penyaring berukuran 0,45 μm.

2. Membudidayakan sel untuk infeksi: Dalam cawan 100 mm, tambahkan 10 mL media pertumbuhan lengkap dengan kepadatan sel 5×10⁵ per hidangan.

3. Infeksi virus: Setelah 24 jam kultur sel, singkirkan seluruh media kultur. Infeksi sel dengan 2 mL supernatan virus yang mengandung Polybrene (konsentrasi akhir: 5-10 μg/mL) pada suhu 37°C selama 3-6 jam.

4. Kumpulkan partikel virus: Tambahkan 8 mL media pertumbuhan lengkap. Setelah 2-3 hari kultur, kumpulkan media kultur untuk memperoleh partikel virus.

Percobaan 2: Transfeksi

1. Kultur sel dalam media pertumbuhan lengkap dengan kepadatan sel sekitar 50%.

2. Setelah 18-24 jam kultur sel, siapkan campuran media pertumbuhan DNA-Polybrene. Tambahkan media pertumbuhan lengkap (2 mL untuk cawan 60 mm, 3 mL untuk cawan 100 mm) dan panaskan hingga 37°C. Campur perlahan 10 ng~10 µg plasmid. Tambahkan Polybrene hingga mencapai konsentrasi akhir 5-10 μg/mL. Aduk perlahan. Setiap komponen harus ditambahkan sesuai urutan yang ditentukan.

3. Keluarkan media kultur dan tambahkan larutan media pertumbuhan DNA-Polybrene ke dalam sel pada suhu 37°C selama 6-20 jam. Aduk perlahan setiap 1,5 jam dalam 6 jam pertama kultur sel.

4. Buang larutan Polybrene dari medium pertumbuhan DNA. Tutupi sel dengan larutan kejut DMSO (15% DMSO dalam 1× HBSS).Kocok perlahan cawan kultur selama 10 detik setiap kali larutan ditambahkan untuk memastikan distribusi yang merata. Inkubasi sel pada suhu 37°C selama 4 menit.

5. Segera keluarkan larutan kejut DMSO dan cuci sel dua kali dengan lembut menggunakan medium pertumbuhan lengkap. Untuk cawan berukuran 60 mm, cuci dengan 5 mL medium kultur setiap kali, dan untuk cawan berukuran 100 mm, cuci dengan 10 mL medium kultur setiap kali.

6. Tambahkan media pertumbuhan lengkap ke sel.

7. Ekspresi protein: Setelah 24-72 jam kultur, kumpulkan sel untuk analisis ekspresi protein sesuai kebutuhan.

Seleksi sel: Setelah 24-72 jam kultur, berdasarkan status sel, alihkan ke media seleksi segar dan lanjutkan dengan seleksi sel.