Reagen Transfeksi Polietilenaimina PEI 25000 Terlinierisasi merupakan polimer kationik bermuatan tinggi yang dengan mudah mengikat molekul asam nukleat bermuatan negatif, membentuk kompleks, dan memungkinkan kompleks tersebut memasuki sel. Reagen transfeksi merupakan reagen transfeksi sementara dengan sitotoksisitas rendah, efisiensi transfeksi tinggi, dan efisiensi ekspresi gen tinggi dalam sel seperti HEK293 dan CHO. Telah diverifikasi bahwa reagen transfeksi PEI linier dapat diaplikasikan secara luas pada berbagai lini sel termasuk HEK-293, HEK293T, CHO-K1, COS-1, COS-7, NIH/3T3, Sf9, HepG2 dan sel Hela, dll. Reagen tersebut kompatibel dengan media yang mengandung serum dan dapat secara efisien memasukkan asam nukleat ke dalam sel.

Spesifikasi

Pengiriman dan Penyimpanan

Produk dikirim pada suhu ruangan dan bubuknya dapat disimpan pada suhu 2-8ºC selama dua tahun. Larutan stok disimpan pada suhu 2-8 ºC selama 3 bulan.

Perhatian


1) Setelah larutan PEI yang disiapkan dikeluarkan dari suhu -20 ºC dan dicairkan, larutan tersebut dapat disimpan dalam lemari es bersuhu 4 ºC dan tidak boleh dibekukan kembali.

2) Untuk sebagian besar sel, 3,0 μL reagen transfeksi PEI per 1 μg DNA dapat mencapai efisiensi transfeksi yang tinggi. Anda juga dapat mencoba menggunakan 1,5~4 μL volume reagen transfeksi PEI linier per 1 μg DNA untuk pengoptimalan.

3) Demi keselamatan dan kesehatan Anda, harap kenakan jas lab, sarung tangan sekali pakai, dan lemari asam selama pengoperasian.

4) Produk ini hanya untuk tujuan penelitian ilmiah, bukan untuk penggunaan manusia.

Persiapan Larutan Stok (1 mg/mL)


1. Bahan

PEI 25000, air Milli-Q®/air untuk injeksi (WFI) atau air bermutu biologis serupa, asam klorida (HCl) 12 mol/L, natrium hidroksida (NaOH) 10 mol/L, filter vakum steril PES sekali pakai 0,1~0,2 μm, botol penyimpanan HDPE atau polipropilena steril.

2. Siapkan larutan stok (1 mg/mL)

1) Dalam gelas kimia 1 L, tambahkan 1 g bubuk PEI 25000 ke dalam 900 mL air ultramurni Milli-Q® atau air biologis setara lainnya, dan aduk rata pada pengaduk magnetik untuk menghasilkan pusaran kecil.

2) Tambahkan asam klorida (12 mol/L) tetes demi tetes sambil diaduk untuk mengatur pH hingga pH<2,0.

3) Tutup bagian atas gelas kimia dan aduk selama 3 jam hingga larut sepenuhnya; jaga pH < 2,0 selama proses berlangsung.

【Catatan】: Mungkin ada beberapa partikel berserat kecil yang tidak dapat larut, yang merupakan fenomena normal.

4) Tambahkan NaOH (10 mol/L) tetes demi tetes sambil diaduk untuk mengatur pH hingga mencapai 6,9 ~7,1.

5) Pindahkan larutan ke dalam gelas ukur dan tambahkan air hingga mencapai 1 L.

6) Saring dan sterilkan dengan filter vakum PES sekali pakai 0,1-0,2 µm untuk mendapatkan larutan stok 1 mg/mL.

7) Aliquot sesuai kebutuhan dan simpan pada suhu -20 °C, stabil selama 1 tahun.

【Catatan】: Setelah mencairkan kembali larutan penyimpanan, dapat disimpan pada suhu 4 °C dan stabil selama 2 minggu, tetapi tidak boleh dibekukan kembali

Prosedur transfeksi (mengambil pelat 6 sumur sebagai contoh)


1. Inokulasi sel: Untuk meningkatkan efisiensi transfeksi, disarankan untuk menginokulasi sel satu hari sebelum transfeksi, dan kepadatan sel pada saat transfeksi sebaiknya 70%~80%.

2. Siapkan kompleks DNA-PEI: Siapkan kompleks reagen transfeksi asam nukleat DNA-PEI sesuai dengan sistem berikut:

1) Untuk setiap sumur sel, encerkan 2 μg DNA target dengan 100 μL medium bebas serum, dan aduk rata untuk membentuk pengenceran DNA.

[Catatan]: Opti-MEM atau ddH2O direkomendasikan untuk pengencer bebas serum

2) Segera tambahkan 5 μL reagen transfeksi PEI 25000 ke dalam 100 μL pengencer DNA, kocok selama 10 detik, dan aduk rata.

3) Inkubasi pada suhu ruangan selama 10-25 menit untuk membentuk kompleks reagen transfeksi asam nukleat kationik DNA-PEI.

3. Sel yang ditransfeksi:

1) Selama pembentukan kompleks, keluarkan media pertumbuhan sel dan tambahkan 2 mL media lengkap segar yang dihangatkan terlebih dahulu ke setiap sumur.

2) Tambahkan 100 μL kompleks asam nukleat-PEI DNA-PEI langsung ke sel, kocok pelat kultur, dan aduk perlahan.

3) Kultur dalam inkubator 37°C, 5% CO2, dan ekspresi transgen dapat dideteksi segera setelah 7 jam setelah transfeksi. Silakan tentukan sendiri waktu pengujian yang sesuai.

4. Penyaringan rotasi tetap (opsional)

24 jam setelah transfeksi, sel-sel dikultur ulang ke dalam media pertumbuhan baru (encerkan sel lebih dari 10 kali), dan diinkubasi semalam pada suhu 37 °C dalam inkubator CO2 5%. Keesokan harinya, obat skrining yang cocok dengan gen resistensi transfeksi ditambahkan. Klon yang resistan terhadap obat dapat disaring dalam waktu sekitar 1 hingga 2 minggu. Selama periode ini, media pertumbuhan yang mengandung obat skrining perlu diganti secara berkala.

Dosis transfeksi untuk berbagai wadah kultur sel (hanya untuk referensi):