Benar Kit Deteksi Residu DNA Sel Inang digunakan untuk analisis kuantitatif residu DNA sel inang Vero dalam sampel antara, produk setengah jadi dan produk jadi dari berbagai produk biologis.

Kit ini menggunakan probe fluoresens Taqman dan metode reaksi berantai polimerase (PCR), yang memiliki batas deteksi minimum tingkat fg dan dapat secara spesifik dan cepat mendeteksi sisa DNA sel Vero. Kit ini perlu digunakan bersama dengan Kit Persiapan Sampel DNA Sisa (Cat# 18461ES).

Produk Komponen

^*IC: Kontrol internal

Pengiriman dan Penyimpanan

1. Dikirim dengan es kering dan disimpan pada suhu -20°C untuk 2 tahun

2. Setelah menerima barang, harap segera periksa dan simpan pada suhu penyimpanan yang sesuai.

Perhatian

1. Harap baca manual ini dengan saksama sebelum menggunakan reagen ini, dan percobaan harus distandarisasi, termasuk penanganan sampel, persiapan sistem reaksi, dan penambahan sampel.

2. Penambahan sampel dan penyiapan larutan paling baik dilakukan di atas es.

3. Pastikan setiap komponen dipusarkan sepenuhnya dan disentrifugasi pada kecepatan rendah sebelum digunakan.

4. Demi keselamatan dan kesehatan Anda, harap kenakan jas lab dan sarung tangan sekali pakai selama pengoperasian.

5. Produk ini HANYA untuk keperluan penelitian!

Model instrumen yang berlaku

Termasuk tetapi tidak terbatas pada:

Bio-Rad: Modul Optik CFX96.

Thermo Ilmiah: ABI 7500; Studio Kuantitatif ABI 5; ABI Langkah OnePlus.

Menggunakan Instruksi

1. Benar Pengenceran Standar DNA dan Persiapan Kurva Standar

Yang Vero Kontrol DNA diencerkan secara gradien menggunakan Penyangga Pengenceran DNA yang disediakan dalam kit, dan konsentrasi pengencerannya adalah 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 Jumlah total partikel (g/μL)

Lihat petunjuk rinci di bawah ini:

1.1 Mencairkan Benar Kontrol DNA dan penyangga pengenceran DNA di atas es. Setelah benar-benar dicairkan, putar perlahan untuk mencampurnya, lalu sentrifus pada kecepatan rendah selama 10 detik.

1.2 Keluarkan enam tabung bersih 1,5 mL, bertanda 3 ng/μL, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥.

1.3 Tambahkan 90 μL buffer pengenceran DNA dan 10 μL Vero Kontrol DNA ke 1.Tabung mikrofus 5 mL berlabel 3 ng/μL, dan encerkan hingga 3 ng/μL. Campur dan kemudian sentrifus selama 10 detik. Masukkan DNA standar yang telah diencerkan ke dalam kemasan dan dapat disimpan dalam jangka pendek (tidak lebih dari 3 bulan) pada suhu -80°C. Harap hindari pembekuan-pencairan berulang.

1.4 Tambahkan 90 μL buffer pengenceran DNA ke dalam tabung, lalu ikuti prosedur di bawah ini untuk pengenceran serial.

[Catatan]:

1. Tiga sumur replikasi diperlukan untuk setiap konsentrasi. Jangkauan deteksi adalah 3 fg/μL-300pg/μL Dan Jangkauan ini dapat diperluas jika diperlukan.

2. Untuk mengurangi jumlah pengulangan pembekuan-pencairan dan menghindari kontaminasi, disarankan untuk menyimpan kontrol DNA dalam alikuot pada suhu -80°C untuk pertama kalinya.

3. Setelah dicairkan, buffer pengenceran DNA bisa disimpan pada suhu 2-8°C selama 7 hari, jika tidak digunakan dalam waktu lama, harap simpan pada suhu -20°C.

4. Pastikan cetakan sudah tercampur sempurna, kocok adonan dengan lembut selama 15 detik hingga 1 menit untuk setiap pengenceran gradien.

2. Persiapan Kontrol Pemulihan Ekstraksi (ERC)

Mengatur konsentrasi dari Vero DNA dalam ERC sesuai kebutuhan (sampel ERC disiapkan dengan 3 pg/μL DNA sebagai contoh), sebagai berikut:

2.1 Tambahkan 100 μL sampel uji ke dalam tabung 1,5 mL yang bersih, lalu tambahkan 10 μL 3pg/μL Vero DNA Standar (③) dan aduk rata, beri tanda ERC.

2.2 Melakukan ekstraksi DNA sampel ERC bersama dengan sampel uji untuk menyiapkan ERC yang dimurnikan mencicipi.

3. Persiapan Sampel Kontrol Positif (PCS) (Opsional)

Mengatur konsentrasi dari Vero DNA dalam PCS sesuai kebutuhan (PCS disiapkan dengan 3 pg/μL DNA sebagai contoh), sebagai berikut:

3.1 Tambahkan 100 μL 3 pg/μL Vero Standar DNA (③) ke dalam tabung bersih 1,5 mL, lalu ditandai sebagai PCS.

3.2 Melakukan ekstraksi DNA PCS bersama dengan sampel uji untuk menyiapkan PCS yang dimurnikan.

4. Negatif Persiapan Larutan Kontrol (NCS)

Tetapkan kontrol negatif dalam percobaan, langkah-langkah operasi spesifiknya adalah sebagai berikut:

4.1 Tambahkan 100 μL matriks sampel (atau penyangga pengenceran DNA) ke dalam tabung bersih 1,5 mL, lalu tandai sebagai NCS.

4.2 Lakukan ekstraksi DNA sampel NCS bersama dengan sampel uji untuk menyiapkan sampel NCS yang dimurnikan.

5. Tidak ada persiapan Kontrol Template (NTC)

Tetapkan tidak ada template kontrol dalam percobaan, langkah-langkah operasi spesifiknya adalah sebagai berikut:

5.1 NTC tidak memerlukan praperlakuan sampel dan dapat dikonfigurasi pada tahap deteksi qPCR terhadap kandungan DNA residu.

5.2 Sampel NTC di setiap tabung atau sumur adalah 20 μL Campuran (yaitu 16 μL Campuran Vero qPCR + 4 μL Campuran Vero Primer&probe) + 20 μL Penyangga Pengenceran DNA. Disarankan untuk mengonfigurasi tiga sumur replikasi.

6. Sistem reaksi PCR

[Catatan]:

1. Hitung total volume reaksi PCR berdasarkan jumlah reaksi: qPCR Mix = (jumlah reaksi + 2) × (16 + 4) μL (termasuk kehilangan dua sumur reaksi). Lebih dari tiga kali ulangan untuk setiap sampel direkomendasikan dalam percobaan.

2. Setelah menutup tabung atau menyegel pelat, sentrifus tabung reaksi atau pelat pada kecepatan rendah selama 10 detik. Setelah mengocok dan mencampur selama 5 detik, ulangi sentrifus untuk mengumpulkan cairan dari tutup atau dinding ke dasar. Hindari gelembung selama pengoperasian.

Lihat tabel di bawah untuk pengaturan Pelat yang direkomendasikan:

Tata letak plat meliputi: 1 NTC (tidak ada templat kontrol), 1 Bahasa Indonesia: NCS (kontrol negatif larutan), 6 STD (kurva standar 6 konsentrasi standar), 3 TS (sampel uji), 3 ERC (kontrol pemulihan ekstraksi), 1 PCS (sampel kontrol positif).Tiga sumur replikasi untuk setiap sampel.

Nomor telepon 7. Pedoman pengaturan untuk Instrumen PCR (metode 2 langkah)

Petunjuk berikut hanya berlaku untuk instrumen Thermo ABI 7500 qPCR (Versi perangkat lunak 2.0). Jika Anda menggunakan instrumen lain, rujuk panduan instrumen yang berlaku untuk panduan pengaturan.

7.1 Hasilkan percobaan baru, pilih templat kuantifikasi absolut atau yang ditentukan pengguna.

7.2 Pada antarmuka 'Tentukan' dan panel 'Target', tambahkan target dan beri nama FAM, pilih reporter sebagai 'FAM' dan peredam sebagai 'tidak ada'.

7.3 Di panel 'Samples', tambahkan semua informasi sampel secara bergantian. Kemudian pilih sumur, pilih target dan sampel yang sesuai. Atur tugas Vero Standar DNA sebagai standar, dan tetapkan nilai 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3 (unit konsentrasi DNA di setiap sumur adalah fg/μL) di kolom Kuantitas, dan beri nama sumur STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6, dengan demikian. Tetapkan tugas NTC sebagai NTC. Tetapkan NCS, TS, ERC dan PCS sebagai Tidak Diketahui, dan beri nama sesuai dengan tata letak Plat di atas. Lalu klik berikutnya.

7.4 Atur program amplifikasi: atur volume reaksi menjadi 40 μL.

8. Analisis hasil qPCR

8.1 Sistem akan secara otomatis memberikan Threshold pada panel Amplification Plot dari Analysis. Threshold yang diberikan oleh sistem terkadang terlalu dekat dengan baseline, yang mengakibatkan perbedaan besar dalam Ct antara sumur replikasi. Anda dapat secara manual menyesuaikan Threshold ke posisi yang sesuai dan mengklik Analyze. Kemudian Anda dapat memeriksa terlebih dahulu apakah kurva amplifikasi normal dalam Multicomponent Plot.

8.2 Pada tab Analisis Hasil, tinjau plot Kurva Standar. Verifikasi nilai untuk Kemiringan, Y-intercept, R2 dan Efisiensi. Untuk kurva standar normal, R²>0,99; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 Dalam 'Tabel tampilan sumur' panel di Analisis, konsentrasi setiap sampel ditunjukkan dalam Kuantitas, satuannya adalah fg/μL, satuannya dapat dikonversi ke pg/μL atau pg/mL dalam laporan pengujian.

Buku Panduan