Kit Deteksi Lentivirus Kompeten Replikasi (RCL) digunakan untuk mendeteksi secara kuantitatif replikasi lentivirus yang mungkin terjadi di berbagai produk sel yang terkait dengan lentivirus vektor potensi risiko.

Kit ini merancang primer khusus untuk Urutan gen VSV-G dari protein amplop lentivirus. Dan itu mengadopsi taqman  probe fluoresensi dan metode reaksi berantai polimerase (PCR), yang memiliki batas deteksi level 1 salinan/μL dan dapat mendeteksi secara spesifik dan cepat risiko lentivirus yang kompeten dalam replikasi. Kit tersebut membutuhkan untuk digunakan bersama dengan Kit Persiapan Sampel DNA Residu (Cat# 18461ES).

Komponen

* IC： Intern kontrol.

Penyimpanan

Produk ini harus disimpan pada suhu -25~-15℃ untuk 2 bertahun-tahun.

Baik 41311-A maupun 41311-B harus disimpan di tempat yang terlindungi dari cahaya.

Berlaku instrumen Model

Termasuk tetapi tidak terbatas pada: Bio-Rad: Modul Optik CFX96; Thermo Scientific: ABI 7500; Studio Kuantitatif ABI 5; ABI Langkah OnePlus.

Instruksi

1. DNA RCL Standar pengenceran Dan Standar melengkung persiapan

Kontrol DNA RCL diencerkan secara gradien menggunakan Penyangga Pengenceran DNA yang disediakan dalam kit* , dan pengenceran konsentrasi adalah 5×10E7 salinan/μL, 5×10E6 salinan/μL, 5×10E5 salinan/μL, 5×10E4 salinan/μL, 5×10E3 salinan/μL, 5×10E2 salinan/μL, 5×10E1 salinan/μL.

Lihat petunjuk rinci di bawah ini:

1) Cairkan kontrol DNA RCL dan penyangga pengenceran DNA di atas es. Setelah benar-benar dicairkan, pusaran dengan lembut ke campuran, dan sentrifus pada kecepatan rendah selama 10 detik.

2) Keluarkan tujuh tabung bersih 1,5 mL, yang diberi tanda Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5, Std6.

3) Tambahkan 90 μL buffer pengenceran DNA dan 10 μL DNA Kontrol RCL ke dalam tabung mikrofuge 1,5 mL berlabel Std0, yaitu   encerkan hingga 5×10E7 salinan/μL. Campur dan kemudian sentrifus selama 10 detik. Masukkan DNA standar yang telah diencerkan ke dalam subkemasan dan dapat disimpan dalam jangka pendek (tidak lebih dari 3 bulan) pada suhu -25~-15℃** Harap hindari pembekuan-pencairan yang berulang.

4) Tambahkan 90 μL buffer pengenceran DNA ke dalam tabung lainnya*** , lalu ikuti prosedur di bawah ini untuk pengenceran serial**** .

Tabel 1 Pengenceran gradien standar

*Tiga mengulangi sumur adalah diperlukan untuk setiap konsentrasi. deteksi jangkauan adalah 5×10E1 salinan/μL~5×10E6 salinan/μL Dan ini jangkauan Bisa menjadi diperluas jika diperlukan.

** Ke mengurangi itu nomor dari mengulang beku-cair Dan menghindari kontaminasi, itu adalah direkomendasikan ke toko itu DNA kontrol di dalam bagian kecil pada -25℃~-15℃ untuk itu Pertama waktu.

*** Sekali dicairkan, DNA pengenceran penyangga bisa menjadi tersimpan pada Suhu 2-8°C untuk 7 hari, jika bukan digunakan untuk A panjang waktu, tolong toko pada -25℃~-15℃ .

**** Membuat Tentu itu templat adalah sama sekali dicampur, dengan lembut menggoyang itu campuran untuk 15 detik ke 1 menit untuk setiap gradien pengenceran.

2. Pemulihan Ekstraksi Kontrol (Kode Pos) persiapan

Atur konsentrasi DNA RCL dalam ERC sesuai kebutuhan (sampel ERC disiapkan dengan 5×10E4 menyalin DNA RCL sebagai contoh), sebagai berikut:

1) Tambahkan 100 Sampel uji μL dimasukkan ke dalam tabung 1,5 mL yang bersih, lalu tambahkan 10 μL 5×10E3 salinan/μL DNA RCL Standar (Std4) dan aduk rata, beri tanda ERC.

2) Lakukan ekstraksi DNA sampel ERC bersama dengan sampel uji untuk menyiapkan sampel ERC yang dimurnikan.

3. Kontrol Negatif Larutan (NCS) persiapan

Tetapkan kontrol negatif dalam percobaan, langkah-langkah operasi spesifiknya adalah sebagai berikut:

1) Tambahkan 100 Matriks sampel μL (atau buffer pengenceran DNA) ke dalam tabung 1,5 mL yang bersih, lalu ditandai sebagai NCS.

2) Melakukan ekstraksi DNA NCS sampel bersama dengan sampel uji untuk menyiapkan NCS yang dimurnikan mencicipi.

4. Tidak ada Template Kontrol (NTC) persiapan

Tetapkan kontrol tanpa templat dalam percobaan, langkah-langkah operasi spesifiknya adalah sebagai berikut:

1) NTC tidak memerlukan pretreatment sampel, dan dapat dikonfigurasi pada tahap deteksi qPCR DNA residual isi.

2) Sampel NTC di setiap tabung atau sumur adalah 20 Campuran μL (yaitu 15 μL RCL qPCR Campuran + 4 μL RCL Primer dan penyelidikan Campuran + 1 (μL IC) + 10 Penyangga Pengenceran DNA μL. Disarankan untuk mengonfigurasi tiga sumur replikasi.

5. PCR reaksi sistem

Tabel 2 Sistem reaksi

* Menghitung itu total PCR reaksi volume oleh itu nomor dari reaksi: qPCR Mencampur =(itu nomor dari reaksi+2) × (15+4+1) μL (termasuk itu Kerugian dua sumur reaksi). Dalam percobaan ini, disarankan untuk melakukan lebih dari tiga kali replikasi untuk setiap sampel.

** Setelah pembatasan itu tabung atau penyegelan itu pelat, sentrifus itu reaksi tabung atau piring pada rendah kecepatan untuk 10 detik. Setelah memadai goncangan Dan percampuran untuk 5 detik, ulangi mesin sentrifus ke mengumpulkan itu cairan dari itu tutup atau dinding ke itu bawah. Hindari gelembung selama operasi.

Lihat tabel di bawah untuk pengaturan Pelat yang direkomendasikan:

Tabel3 Komputer-aktif referensi papan

Tata letak pelat meliputi: 6 Std (kurva standar 6 konsentrasi standar), 1 NTC (tanpa kontrol templat), 1 NCS (larutan kontrol negatif), 3 TS (sampel uji), 3 ERC (kontrol pemulihan ekstraksi).Tiga sumur replikasi untuk setiap sampel.

6. Pedoman pengaturan untuk A PCR Instrumen

Petunjuk berikut hanya berlaku untuk Termo Instrumen ABI 7500 qPCR (Perangkat Lunak versi 2.0). Jika kamu menggunakan instrumen yang berbeda, rujuk pada panduan instrumen yang berlaku untuk panduan pengaturan.

1) Hasilkan percobaan baru, pilih templat kuantifikasi absolut atau ditentukan pengguna.

2) Buat 1 probe deteksi, bernama "RCL-DNA", pilih reporter fluorofor sebagai "FAM" dan padamkan fluorofor sebagai “tidak ada”; buat 1 probe deteksi lagi, beri nama “IC” dan pilih reporter fluorofor sebagai “CY5" dan pendinginan fluorofor sebagai "tidak ada". Fluoresensi referensi adalah ROX" (fluoresensi referensi dapat didasarkan pada model instrumen, dll., pilih apakah (Anda perlu menambahkannya).

3) Di dalam Panel 'Sampel', tambahkan semua informasi sampel secara bergantian. Kemudian pilih sumur, pilih target dan sampelnya sesuai dengan itu. Mengatur tugas standar DNA RCL sebagai standar, dan menetapkan nilai 5000000, 500000, 50000, 5000, 500, 50 (satuan konsentrasi DNA di setiap sumur adalah salinan/μL) di kolom Kuantitas, dan beri nama  sumur Std 1, Std 2, Std 3, Std 4, Std 5, Std 6, masing-masing. Atur tugas NTC sebagai NTC. Tetapkan NCS, TS, dan ERC sebagai Tidak diketahui, dan menamakannya sesuai dengan tata letak Plat di atas. Lalu klik berikutnya.

4) Atur program amplifikasi: atur volume reaksi menjadi 30 μL.

Tabel 4 Prosedur Amplifikasi

7. Analisis dari qPCR hasil

1) Sistem akan secara otomatis memberikan Threshold Di Panel Plot Amplifikasi Analisis. Ambang batas yang diberikan oleh sistem terkadang terlalu dekat dengan garis dasar, sehingga mengakibatkan perbedaan yang besar di Ct antara sumur replikasi. Anda dapat menyesuaikan secara manual Ambang batas ke posisi yang sesuai dan klik Analisis. Kemudian Anda dapat memeriksa terlebih dahulu apakah kurva amplifikasi normal dalam Plot Multikomponen.

2) Dalam Hasil Tab Analisis, tinjau plot Kurva Standar. Verifikasi nilai untuk R2, Efisiensi, Kemiringan dan Y-intercept. Untuk kurva standar normal, R²>0,99, 90%≤Eff%≤110%, -3,6≤Slope≤-3,1.

3) Di dalam 'Melihat panel meja sumur Analisis, konsentrasi masing-masing sampel ditunjukkan dalam Kuantitas, satuan adalah salinan/μL, satuannya dapat dikonversi dalam laporan pengujian.

4) Pengaturan parameter analisis hasil perlu didasarkan pada model spesifik dan perangkat lunak versi digunakan, dan secara umum dapat diinterpretasikan secara otomatis oleh instrumen.

5) Hitunglah tingkat pemulihan lonjakan berdasarkan hasil pengujian contoh TS untuk diukur dan sampel lonjakan pemulihan ERC, tingkat pemulihan paku diperlukan menjadi antara 50%~150%. Rumus pengukur tingkat pemulihan yang melonjak:

Pemulihan (%) = {Sample spiked assay (eg.copies/μL) - Sample assay (eg.copies/μL)} x Volume elusi (μL) / Teoretis nilai jumlah penambahan DNA (mis.salinan) x 100%

6) Ct nilai dari kontrol negatif NCS harus lebih besar dari rata-rata konsentrasi Ct terendah itu standar.

7) Template kontrol NTC gratis harusnya Tidak Ditentukan atau Ct nilai ≥38.

Catatan

1. Produk ini hanya untuk keperluan penelitian.
2. Harap bekerja dengan jas lab dan sarung tangan sekali pakai, demi keselamatan Anda.

3. Harap baca manual ini dengan seksama sebelum menggunakan reagen ini, dan percobaan harus distandarisasi, termasuk penanganan sampel, persiapan sistem reaksi dan penambahan sampel.

4. Pastikan setiap komponen dipusarkan sepenuhnya dan disentrifugasi pada kecepatan rendah sebelum digunakan.

Buku petunjuk