HEK293 Kit Deteksi Residu DNA Sel Host digunakan untuk analisis kuantitatif HEK293 residu DNA sel inang dalam sampel antara, produk setengah jadi dan produk jadi dari berbagai produk biologis.

Kit ini mengadopsi probe fluoresensi Taqman dan metode reaksi berantai polimerase (PCR), yang memiliki batas deteksi minimum tingkat fg dan dapat secara khusus dan cepat mendeteksi residu HEK293 DNA sel. Penggunaan gabungan enzim UDG dan dUTP dapat menghilangkan kontaminasi yang disebabkan oleh produk amplifikasi. Kit ini perlu digunakan bersama dengan Kit Persiapan Sampel DNA Residu (Cat# 18461ES).

Laporan Validasi

Spesifikasi

Komponen

Penyimpanan

Produk ini sebaiknya disimpan pada suhu -25~-15℃ selama 2 tahun.

Baik 41331-A maupun 41331-B harus disimpan di tempat yang terlindungi dari cahaya.

Model instrumen yang berlaku

Termasuk tetapi tidak terbatas pada:

Bio-Rad: Modul Optik CFX96.

Thermo Scientific: ABI 7500; ABI Quant Studio 5.

Instruksi

1. HEK293Pengenceran Standar DNA dan Persiapan Kurva Standar

HEK293 Kontrol DNA diencerkan secara gradien menggunakan Penyangga Pengenceran DNA yang disediakan dalam kit.^*, dan pengenceran

konsentrasinya adalah 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL.

Lihat petunjuk rinci di bawah ini:

• Cairkan kontrol HEK293DNA dan buffer pengenceran DNA di atas es. Setelah benar-benar mencair, putar perlahan untuk mencampur, dan sentrifus pada kecepatan rendah selama 10 detik.
• Keluarkan enam tabung bersih 1,5 mL, yang diberi tanda Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5.
• Tambahkan 90 μL buffer pengenceran DNA dan 10 μL Kontrol HEK293DNA ke tabung mikrofuge 1,5 mL berlabel Std0, yaitu encerkan hingga 3 ng/μL. Campur dan kemudian sentrifus selama 10 detik. Masukkan DNA standar yang telah diencerkan ke dalam kemasan dan dapat disimpan dalam jangka pendek (tidak lebih dari 3 bulan) pada suhu -25~-15℃^**Harap hindari pembekuan-pencairan yang berulang.
• Tambahkan 90 μL buffer pengenceran DNA ke tabung lainnya^***, kemudian ikuti prosedur di bawah ini untuk pengenceran serial^****.

Tabel 1 Pengenceran gradien standar

^*Tiga sumur replikasi diperlukan untuk setiap konsentrasi. Rentang deteksi adalah 30 fg/μL~300pg/μL dan kisaran ini dapat diperluas.

^**Untuk mengurangi jumlah pengulangan pembekuan-pencairan dan menghindari kontaminasi, disarankan untuk menyimpan kontrol DNA dalam alikuot pada suhu -25~-15℃ untuk pertama kalinya.

^***Setelah dicairkan, buffer pengenceran DNA dapat disimpan pada suhu 2-8°C selama 7 hari, jika tidak digunakan dalam waktu lama, harap simpan pada suhu -25~-15℃.

^****Pastikan templat tercampur sempurna, kocok campuran perlahan selama 15 detik hingga 1 menit untuk setiap pengenceran gradien.

2. Persiapan Kontrol Pemulihan Ekstraksi (ERC)

Tetapkan konsentrasi DNA HEK293 dalam ERC sesuai kebutuhan (sampel ERC disiapkan dengan 30 pg DNA HEK293 sebagai contoh), sebagai berikut:

• Tambahkan 100 μL sampel uji ke dalam tabung bersih 1,5 mL, lalu tambahkan 10 μL 3pg/μL HEK293 DNA Standar (Std3) dan aduk rata, tandai sebagai ERC.
• Lakukan ekstraksi DNA sampel ERC bersama dengan sampel uji untuk menyiapkan sampel ERC yang dimurnikan.

3. Persiapan Larutan Kontrol Negatif (NCS)

Tetapkan kontrol negatif dalam percobaan, langkah-langkah operasi spesifiknya adalah sebagai berikut:

1) Tambahkan 100 μL matriks sampel (atau buffer pengenceran DNA) ke dalam tabung 1,5 mL yang bersih, lalu tandai sebagai NCS.

2) Lakukan ekstraksi DNA sampel NCS bersama dengan sampel uji untuk menyiapkan sampel NCS yang dimurnikan.

4. Tidak ada persiapan Kontrol Template (NTC)

Tetapkan kontrol tanpa templat dalam percobaan, langkah-langkah operasi spesifiknya adalah sebagai berikut:

1) NTC tidak memerlukan praperlakuan sampel, dan dapat dikonfigurasi pada tahap deteksi qPCR DNA sisa.

2) Sampel NTC dalam setiap tabung atau sumur adalah 20 μL Campuran (yaitu 15 μL Campuran HEK293 qPCR + 5 μL Campuran Primer&probe HEK293) + 10 μL Penyangga Pengenceran DNA. Disarankan untuk mengonfigurasi tiga sumur replikasi.

5. Sistem reaksi PCR

Tabel 2 Sistem reaksi

^*Hitung total volume reaksi PCR berdasarkan jumlah reaksi: qPCR Mix = (jumlah reaksi + 2) × (15 + 5) μL (termasuk kehilangan dua sumur reaksi). Lebih dari tiga kali ulangan untuk setiap sampel direkomendasikan dalam percobaan.

^**Setelah menutup tabung atau menyegel pelat, sentrifus tabung reaksi atau pelat pada kecepatan rendah selama 10 detik. Setelah mengocok dan mencampur selama 5 detik, ulangi sentrifus untuk mengumpulkan cairan dari tutup atau dinding ke dasar. Hindari gelembung selama pengoperasian.

Lihat tabel di bawah untuk pengaturan Pelat yang direkomendasikan:

Tabel 3 Komputer pada papan referensi

Tata letak pelat meliputi: 5 Std (kurva standar dari 5 konsentrasi standar), 1 NTC (tanpa kontrol templat), 1 NCS (larutan kontrol negatif), 3 TS (sampel uji), 3 ERC (kontrol pemulihan ekstraksi).Tiga sumur replikasi untuk setiap sampel.

6. Pengaturan pedoman untuk Instrumen PCR(metode 2 langkah) (misalnya instrumen Thermo ABI 7500 qPCR, perangkat lunak versi 2.0)

Petunjuk berikut ini hanya berlaku untuk instrumen Thermo ABI 7500 qPCR (versi perangkat lunak 2.0). Jika Anda menggunakan instrumen lain, rujuk panduan instrumen yang berlaku untuk panduan pengaturan.

1) Hasilkan percobaan baru, pilih templat kuantifikasi absolut atau yang ditentukan pengguna.

2) Buat 1 probe deteksi, bernama "HEK293-DNA", pilih fluorofor reporter sebagai "FAM" dan matikan fluorofor sebagai "None". Fluoresensi referensi adalah "ROX" (fluoresensi referensi dapat didasarkan pada model instrumen, dll., pilih apakah Anda perlu menambahkannya).

3) Di panel 'Samples', tambahkan semua informasi sampel secara bergantian. Kemudian pilih sumur, pilih target dan sampel yang sesuai. Atur tugas HEK293 Standar DNA sebagai standar, dan tetapkan nilai 300000, 30000, 3000, 300, 30 (satuan konsentrasi DNA di setiap sumur adalah fg/μL) di kolom Kuantitas, dan beri nama sumur Std 1, Standar 2, Standar 3, Standar 4, Standar 5, dengan demikian. Tetapkan tugas NTC sebagai NTC. Tetapkan NCS, TS, dan ERC sebagai Tidak Diketahui, dan beri nama sesuai dengan tata letak Plat di atas. Lalu klik berikutnya.

4) Atur program amplifikasi: atur volume reaksi menjadi 30 μL.

Tabel 4 Prosedur Amplifikasi

7. Analisis hasil qPCR

1) Sistem akan secara otomatis memberikan Threshold pada panel Amplification Plot dari Analysis. Threshold yang diberikan oleh sistem terkadang terlalu dekat dengan baseline, yang mengakibatkan perbedaan besar dalam Ct antara sumur replikasi. Anda dapat secara manual menyesuaikan Threshold ke posisi yang sesuai dan klik Analyze. Kemudian Anda dapat memeriksa terlebih dahulu apakah kurva amplifikasi normal dalam Multicomponent Plot.

2) Pada tab Analisis Hasil, tinjau plot Kurva Standar. Verifikasi nilai untuk R²Efisiensi, Kemiringan dan Y-intercept. Untuk kurva standar normal, R²>0.99, 90%≤Eff%≤110%, -3,6≤Kemiringan≤-3,1.

3) Pada panel 'Lihat tabel sumur' dalam Analisis, konsentrasi setiap sampel ditunjukkan dalam Kuantitas, satuannya adalah fg/μL, satuannya dapat dikonversi dalam laporan pengujian.

4) Pengaturan parameter analisis hasil perlu didasarkan pada model spesifik dan versi perangkat lunak yang digunakan, dan umumnya dapat diinterpretasikan secara otomatis oleh instrumen.

5) Hitung tingkat pemulihan lonjakan berdasarkan hasil pengujian sampel TS yang akan diukur dan ERC pemulihan lonjakan sampel, tingkat pemulihan lonjakan harus berada antara 50% ~ 150%. Rumus meteran tingkat pemulihan lonjakan: Pemulihan (%) = {Sample spiked assay (eg.pg/μL) - Sample assay (eg.pg/μL)} x Volume elusi (μL) / Nilai teoritis jumlah penambahan DNA (misalnya pg) x 100%。

6) Nilai Ct dari kontrol negatif NCS harus lebih besar daripada nilai rata-rata Ct konsentrasi terendah dari standar.

• Kontrol bebas template NTC harus Tidak ditentukan atau nilai Ct ≥3

Catatan

1. Produk ini hanya untuk keperluan penelitian.
2. Harap bekerja dengan jas lab dan sarung tangan sekali pakai, demi keselamatan Anda.

3. Harap baca manual ini dengan saksama sebelum menggunakan reagen ini, dan percobaan harus distandarisasi, termasuk penanganan sampel, persiapan sistem reaksi, dan penambahan sampel.

4. Pastikan setiap komponen dipusarkan sepenuhnya dan disentrifugasi pada kecepatan rendah sebelum digunakan.

Buku Panduan