Kit Uji Spesies Oksigen Reaktif menggunakan reagen permeabel sel 2',7'–diklorofluorescin diasetat (DCFDA) untuk menilai spesies oksigen reaktif secara kuantitatif dalam sampel sel hidup. DCFDA non-fluoresens lipofilik mudah melintasi membran sel melalui difusi pasif diikuti oleh deasetilasi. Produk deasetilasi adalah 2',7'-diklorofluorescein (DCHF) yang peka terhadap oksidan. DCHF kemudian dioksidasi oleh ROS untuk membentuk DCF. DCF sangat berfluoresensi dan dideteksi oleh spektroskopi fluoresensi atau Flow cytometry dengan eksitasi/emisi pada 480 nm/525 nm. Rosup, campuran senyawa, adalah penginduksi ROS dan dapat digunakan sebagai kontrol positif.

Komponen Produk

Pengiriman dan Penyimpanan

Kit ini dilengkapi dengan kantong es. Simpan pada suhu -20°C tanpa cahaya selama 1 tahun. Hindari pembekuan dan pencairan berulang kali.

Cara penggunaan

1. Persiapan Reagen
Larutan DCFH-DA: Sentrifus sebentar pada kecepatan rendah sebelum dibuka. Siapkan larutan DCFH-DA yang berfungsi dengan mengencerkan 10 mM DCFH-DA dalam medium bebas serum untuk menghasilkan konsentrasi akhir 10 μM.
[Catatan]: DCFH-DA juga dapat diencerkan dalam media tanpa fenol merah. Gunakan larutan DCFH-DA yang baru disiapkan, penyimpanan jangka panjang DCFH-DA yang telah diencerkan tidak direkomendasikan. Konsentrasi pasti DCFH-DA yang dibutuhkan akan bergantung pada garis sel yang digunakan, tetapi kisaran awal umumnya adalah 10-50 μM. Untuk sel tertentu, jika fluoresensi kontrol negatif (tanpa probe DCFH-DA) sangat kuat, encerkan DCFH-DA hingga 2-5 μM dan persingkat waktu inkubasi. dengan tepat.
Larutan Rosup: Siapkan larutan kerja Rosup 100 µM dengan mengencerkan larutan stok Rosup 100 mM dalam medium bebas serum. Secara umum, inkubasi dengan Rosup pada suhu 37 ℃ selama 30 menit-4 jam dalam kondisi gelap dapat meningkatkan ROS secara signifikan.
[Catatan]: Waktu inkubasi Rosup akan bergantung pada sensitivitas lini sel. Misalnya, 30 menit untuk Hela dan 1,5 jam untuk MRC5. Jika peningkatan ROS tidak diamati dalam waktu 30 menit, waktu induksi atau konsentrasi dapat ditingkatkan dengan tepat. Jika ROS meningkat terlalu cepat, waktu induksi atau konsentrasi dapat dikurangi dengan tepat.
Obat: Siapkan obat yang diinginkan dalam media lengkap dengan 10% FBS atau larutan lain yang sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan.
2. Protokol yang Direkomendasikan untuk Sel yang Melekat
a) Persiapan sel: Tumbuhkan sel-sel yang melekat dalam media kultur sel standar sehari sebelum percobaan sehingga konfluensi sel mencapai 70% pada saat percobaan.
b) Induksi obat: Keluarkan media. Lapisi setiap sumur dengan obat encer bebas serum yang telah disiapkan sebelumnya dan inkubasi selama waktu yang diinginkan pada suhu 37°C dalam keadaan gelap.
c) (Opsional) Kontrol positif: Lapisi sumur kontrol positif dengan larutan Rosup yang telah disiapkan sebelumnya dan inkubasi selama waktu yang diinginkan pada suhu 37°C dalam gelap.
[Catatan]: Untuk sel dengan waktu stimulasi pendek (biasanya dalam 2 jam), probe juga dapat dimuat terlebih dahulu, lalu menambahkan Rosup atau obat yang diinginkan.
d) Pemuatan probe ROS: Buang semua medium dan cuci sel dengan medium bebas serum sebanyak 1-2 kali. Lapisi setiap sumur dengan larutan DCFH-DA yang telah disiapkan sebelumnya. Inkubasi pada suhu 37℃ selama 30 menit dalam keadaan gelap.
e) Buang medium dan cuci sel 1-2 kali dengan medium bebas serum untuk menghilangkan DCFH-DA bebas.
3. Protokol yang Direkomendasikan untuk Sel Suspensi
a) Persiapan sel: Tumbuhkan sel suspensi hingga sekitar 1,5 × 105 sel per sumur pada hari percobaan.
b) Induksi obat: Kumpulkan sel dalam tabung kerucut dengan cara sentrifugasi dan suspensikan kembali dalam jumlah yang tepat dari obat encer bebas serum yang telah disiapkan sebelumnya dan inkubasi selama waktu yang diinginkan pada suhu 37°C dalam gelap.
c) (Opsional) Kontrol positif: Suspensikan kembali sel kontrol positif dengan larutan Rosup yang disiapkan sebelumnya dan inkubasi selama waktu yang diinginkan pada suhu 37°C dalam gelap.
d) Pemuatan probe ROS: Kumpulkan dalam tabung baru dan cuci sel dengan sentrifugasi dua kali dalam PBS. Suspensikan kembali sel dengan Larutan DCFH-DA yang telah disiapkan sebelumnya dengan kepadatan sel pada 1×106-2×107/mL. Kemudian inkubasi pada suhu 37℃ selama 30 menit dalam gelap. Balikkan tabung setiap 3-5 menit untuk memastikan kontak penuh antara probe dan sel.
[Catatan]: Kepadatan sel harus disesuaikan dengan metode deteksi selanjutnya. Misalnya, untuk flow cytometry, jumlah sel dalam satu tabung tidak boleh kurang dari 104/mL atau lebih dari 106/mL.
e) Kumpulkan dan cuci sel dengan sentrifugasi dua kali dengan media bebas serum untuk menghilangkan DCFH-DA bebas.
4. Deteksi Fluoresensi dan Analisis Data
Mikroskopi fluoresensi Pengukuran: Lakukan mikroskopi sel hidup dengan rangkaian filter yang sesuai untuk fluorescein (FITC) menggunakan mikroskop fluoresensi. Nilai kecerahan sel secara visual dan bandingkan antara kontrol dan sampel atau gunakan metode analisis gambar untuk membandingkan sinyal antara foto digital sel.
Pengukuran Flow Cytometry: Sel-sel yang menempel harus dikumpulkan dengan tripsin untuk menyiapkan suspensi sel tunggal; Untuk sel suspensi, sel-sel dikumpulkan secara langsung. Idealnya, 10.000 sel harus dianalisis per kondisi eksperimen. Sel-sel tidak boleh terlalu padat selama eksperimen (<1 ×106 sel/mL). Singkirkan serpihan dan isolasi populasi sel yang diinginkan dengan gating. Dengan menggunakan intensitas fluoresensi rata-rata, tentukan perubahan lipatan antara sampel kontrol dan sampel yang diobati dengan Ex/Em = 480/525 nm.
Pengukuran Mikroplat Fluoresensi: Ukur plat segera pada pembaca plat fluoresensi pada Ex/Em = 480/525 nm dalam mode titik akhir dengan adanya media. Kurangi pembacaan kosong dari semua pengukuran dan tentukan perubahan lipatan dari kontrol pengujian.

Perhatian

1. Cuci sel setelah diinkubasi dengan DCFH-DA untuk mengurangi kebisingan latar belakang.
2. Disarankan untuk mengukur fluoresensi sesegera mungkin setelah inkubasi untuk menghindari kemungkinan kesalahan.
3. Demi keselamatan dan kesehatan Anda, harap kenakan jas lab dan sarung tangan sekali pakai selama operasi.
4. Hanya untuk keperluan penelitian!