Puromisin adalah antibiotik aminoglikosida yang diproduksi melalui fermentasi dan metabolisme Streptomyces alboniger, yang membunuh bakteri Gram-positif, berbagai sel hewan dan serangga dengan menghambat sintesis protein. Puromisin efektif terhadap E. coli dalam beberapa kasus. Mekanismenya adalah puromisin adalah analog dari terminal 3´ molekul aminoil-TrNA, yang dapat mengikat situs A ribosom dan dimasukkan ke dalam rantai peptida yang diperluas. Setelah puromisin mengikat situs A, puromisin tidak akan berpartisipasi dalam reaksi selanjutnya, yang mengakibatkan penghentian sintesis protein secara prematur dan pelepasan polipeptida yang belum matang yang mengandung puromisin di terminal C.

Gen pac yang ditemukan pada strain Streptomyces alboniger penghasil puromisin mengkode puromisin N-asetiltransferase (PAC) yang memberikan resistensi terhadap puromisin. Sifat ini sekarang umum digunakan untuk menyaring garis sel mamalia yang ditransfeksi secara stabil yang membawa plasmid gen pac.

Aplikasi umum puromisin dalam pemilihan transfeksi sel yang stabil terkait dengan karakteristik vektor lentivirus. Sebagian besar vektor lentivirus komersial kini membawa gen pac. Dalam beberapa kasus tertentu, puromisin juga dapat digunakan untuk menyaring transformasi galur E. coli yang membawa plasmid gen pac.

Produk ini cocok untuk kultur sel, konsentrasi kerja umum adalah 1-10 µg/mL.

Selain itu, Yeasen perusahaan juga menyediakan puromisin (nomor seri 60209ES) dalam bentuk larutan, yang berada dalam keadaan berbeda tetapi memiliki fungsi yang sama.

Fitur

Kemurnian≥98%

Aplikasi

Cocok untuk kultur sel

Sstrain sel mamalia spesifik yang ditransfeksi secara stabil yang membawa plasmid pembawa gen pac

Layar itu strain E. coli yang ditransformasi yang membawa plasmid gen pac

Spesifikasi

Komponen

Pengiriman dan Penyimpanan

Itu Puromisin Dihidroklorida produk harus disimpan pada suhu -15℃ ~ -25℃ untuk 2 bertahun-tahun.

Instruksi

1. Konsentrasi kerja yang disarankan

Sel mamalia: 1-10 akug/mL, konsentrasi optimum perlu ditentukan dengan kurva pembunuhan.

Escherichia coli: Media agar LB digunakan untuk menyaring Escherichia coli yang ditransformasi secara stabil dengan gen pac pada konsentrasi 125 akuSatuan unit pengukuran:

Catatan: Penyaringan strain E. coli yang stabil menggunakan puromisin memerlukan penyesuaian pH yang tepat.

Konsentrasi yang direkomendasikan puromisin hidroklorida

2. Metode Pembubaran

Larutkan puromisin dalam air suling untuk menyiapkan larutan stok 50 mg/mL. Setelah sterilisasi dengan penyaringan melalui 0,22 akum filter membran, alikuot dan simpan pada suhu -25 hingga -15℃Atau, dapat dilarutkan dalam metanol untuk menyiapkan larutan penyimpanan 10 mg/mL.

3. Penentuan puromisin kurva pembunuhan (mengambil contoh transfeksi shRNA atau transduksi lentivirus)

Konsentrasi penyaringan yang efektif dari puromisin terkait dengan jenis sel, kondisi pertumbuhan, kepadatan sel, metabolisme sel, dan posisi siklus sel. Untuk menyaring lini sel shRNA yang mengekspresikan secara stabil, sangat penting untuk menentukan konsentrasi minimum puromisin yang dapat membunuh sel yang tidak ditransfeksi/ditransduksi. Disarankan agar pelanggan yang melakukan eksperimen untuk pertama kalinya harus membuat kurva pembunuhan yang sesuai untuk sistem eksperimen mereka sendiri.

1) Hari 1: Plat 24 sumur dilapisi dengan kepadatan 5-8Bahasa Indonesia:104 sel/sumur, dan sejumlah sumur yang cukup disiapkan untuk percobaan gradien berikutnya. Sel diinkubasi semalam pada suhu 37℃.

2) Hari ke-2: A) Siapkan media skrining: media segar yang mengandung berbagai konsentrasi puromisin (seperti 0-15 akug/mL, minimal 5 gradien); B) Ganti media penyaringan yang baru disiapkan di dalam sel setelah inkubasi semalaman; Kemudian sel diinkubasi pada suhu 37℃.

3) Hari ke-4: Ganti dengan media seleksi baru dan amati kelangsungan hidup sel.

4) Tergantung pada kondisi pertumbuhan sel, ganti ke media seleksi segar setiap 2-3 hari.

5) Sel dipantau setiap hari untuk mengamati laju sel yang hidup guna menentukan konsentrasi terendah obat yang efektif untuk membunuh sel yang tidak ditransfeksi atau semua sel yang tidak ditransduksi dalam waktu 4-6 hari sejak dimulainya penyaringan antibiotik.

4. Penyaringan Garis Sel Mamalia yang Ditransfeksi Secara Stabil

Setelah transfeksi plasmid yang mengandung gen pac, sel diperbanyak dalam medium yang mengandung puromisin untuk memilih transfektan yang stabil.

1) 48 jam setelah transfeksi, sel (asli atau diencerkan) dikultur dalam media segar yang mengandung konsentrasi puromisin yang sesuai.

Catatan: Antibiotik paling efektif saat sel sedang aktif membelah. Jika sel terlalu padat, efektivitas antibiotik akan berkurang secara signifikan. Sebaiknya sel ditanam pada pelat dengan kepadatan tidak lebih dari 25%.

2) Hapus dan ganti media kultur yang berisi puromisin setiap 2-3 hari.

3) Fokus yang terbentuk dari sel dinilai 7 hari setelah penyaringan. Lesi mungkin memerlukan waktu tambahan seminggu atau lebih, tergantung pada garis sel inang dan efisiensi penyaringan transfeksi.

Catatan: Amati status pertumbuhan sel setiap hari. Penyaringan puromisin memerlukan waktu setidaknya 48 jam, dan periode penyaringan konsentrasi puromisin yang efektif umumnya 3-10 hari.

4) Pindahkan dan tempatkan 5-10 klon resisten ke dalam cawan Petri 35 mm dan lanjutkan kultur dengan media seleksi selama 7 hari. Kultur pengayaan ini untuk mempersiapkan percobaan sitotoksisitas di masa mendatang..

Dokumen:

Lembar Data Keselamatan

60210Dokumen Referensi _MSDS_HB220421_ID.pdf

Buku Panduan

60210Buku Panduan HB250114_ID.pdf

Kutipan & Referensi:

[1] Furge KA. et al., 2001. Penekanan tumorigenisitas dan metastasis yang dimediasi Ras melalui penghambatan tirosin kinase reseptor Met. PNAS 98:10722-7.

[2] Díaz J. et al., 2014. Rab5 diperlukan dalam sel kanker metastasis untuk aktivasi, migrasi, dan invasi Rac1 yang ditingkatkan Caveolin-1. J Cell Sci. 127:2401-6.

[3] Rössger K. et al., 2013. Kontrol hipertensi berbasis penghargaan oleh antarmuka otak-dopamin sintetis. PNAS, 110:18150-5.

[4] Kamer I. et al., 2005. Proapoptotik BID adalah efektor ATM dalam respons kerusakan DNA Sel. 122:593-603.

[5] Charnaux N. et al., 2005. RANTES (CCL5) menginduksi pelepasan syndecan-1 (CD138) dan syndecan-4 yang dipercepat bergantung pada CCR5 dari sel dan bentuk HeLa.

[6] Gao J, Zhao N, Knutson MD, dkk. Protein Hemokromatosis Hereditas, HFE, Menghambat Penyerapan Zat Besi melalui Penurunan Regulasi Zip14 pada Sel HepG2[J]. Jurnal Kimia Biologi, 2008, 283(31):21462-8.

[7] Huang J, Dibble CC, Matsuzaki M, et al. Kompleks TSC1-TSC2 diperlukan untuk aktivasi mTOR2 yang tepat[J]. Biologi Molekuler dan Seluler, 2008, 28(12):4104-4115.

[8] Nasser MW, Datta J, Nuovo G, dkk. Nasser MW, Datta J, Nuovo G, Kutay H, Motiwala T, Majumder S, Wang B, Suster S, Jacob ST, Ghoshal KPenurunan regulasi mikro-RNA-1 (miR-1) pada kanker paru. Penekanan sifat tumorigenik sel kanker paru dan sensitisasinya terhadap apoptosis yang diinduksi doksorubisin oleh miR-1. J Biol Chem 283: 33394-33405[J]. Jurnal Kimia Biologi, 2008, 283(48):33394-33405.

[9] Paatero AO, Hilkka T, Happonen LJ, dkk. Integrasi bakteriofag Mu dalam genom ragi dan mamalia [J]. Penelitian Asam Nukleat, 2008, 36(22): e148-e148.

[10] Zhang D, dkk. Jalur cGAS-STING-PERK non-kanonik memfasilitasi program translasi yang penting untuk penuaan dan fibrosis organ. Nat Cell Biol. 2022 Mei;24(5):766-782. doi: 10.1038/s41556-022-00894-z. Terbit secara elektronik pada 2 Mei 2022. PMID: 35501370.

[11] Lu T, dkk. CD73 dalam vesikel ekstraseluler kecil yang berasal dari HNSCC mendefinisikan imunosupresi terkait tumor yang dimediasi oleh makrofag di lingkungan mikro. J Extracell Vesicles. 2022 Mei;11(5): e12218. doi: 10.1002/jev2.12218. PMID: 35524455; PMCID: PMC9077142.

[12] Chen S, dkk.Identifikasi protease 32 spesifik ubiquitin sebagai onkogen pada glioblastoma dan mekanisme yang mendasarinya. Sci Rep. 2022 Apr 19;12(1):6445. doi: 10.1038/s41598-022-09497-y. PMID: 35440702; PMCID: PMC9018837.

[13] Han L, dkk. Protein terkait globulin uterus 1 (UGRP1) mengikat podoplanin (PDPN) untuk mendorong jalur peradangan baru selama infeksi Streptococcus pneumoniae. Clin Transl Med. 2022 Jun;12(6): e850. doi: 10.1002/ctm2.850. PMID: 35652821; PMCID: PMC9161880.

[14] Sun Q, dkk. Sumbu MORTALIN-Ca2+ mendorong resistensi rituximab bawaan pada limfoma sel B besar difus. Cancer Lett. 2022 1 Juli; 537:215678. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215678. Terbit elektronik 2022 18 April. PMID: 35447282.