Sulfat G418, juga dikenal sebagai Sulfat Genetikin, adalah antibiotik amino-glikosida dan secara struktural mirip dengan Gentamycin B1. Obat ini mengganggu sintesis protein dengan mengikat ribosom 80-an dan menghalangi langkah-langkah pemanjangan. Sulfat G418 bersifat toksik bagi sel prokariotik dan eukariotik, termasuk bakteri, ragi, sel tumbuhan tingkat tinggi dan mamalia, serta protozoa dan cacing. Gen resistensi (terutama neo), yang berlokasi di transposon Tn601 (903) atau Tn5, berasal dari bakteri, tetapi dapat diekspresikan dalam sel eukariotik. Gen resistensi dapat dimasukkan ke dalam sel melalui teknik rekombinasi gen untuk memperoleh resistensi G418, yang dapat digunakan untuk menyaring dan memelihara kultur sel prokariotik atau eukariotik yang membawa gen resistensi.

Pada sel mamalia, neo, mengkodekan ekspresi amino-glikosida 3'-fosfotransferase (APH (3') II) setelah diintegrasikan ke dalam genom eukariotik. Enzim ini menonaktifkan antibiotik dengan memodifikasi fungsi amino atau hidroksil G418 secara kovalen dan menghambat interaksi antibiotik-ribosom, sehingga sel memiliki resistensi terhadap G418. Dalam percobaan penyaringan garis sel yang stabil, kurva pembunuhan (kurva dosis-respons) harus ditetapkan untuk menentukan konsentrasi efektif minimum untuk membunuh sel yang tidak resistan.

Pada sel tanaman, resistensi dapat diperoleh melalui transfeksi plasmid resistan gen nptII. Gen nptII juga mengkode aminoglikosida fosfotransferase, enzim yang menonaktifkan beberapa antibiotik, termasuk G418, kanamisin, dan palomisin.

Fitur

Kemurnian≥98%

Produksi standar, menggunakan mode produksi massal pabrik

Berbagai macam aplikasi, yang dapat digunakan dalam bidang biologi molekuler dan penelitian eksperimental biokimia kultur jaringan

Platform kerjasama mencakup keseluruhan

Untuk memastikan stabilitas kualitas produk, perbedaan antar batch dikontrol dalam 1%

Aplikasi

Penyaringan garis sel yang ditransfeksi secara stabil

Spesifikasi

Komponen

Pengiriman dan Penyimpanan

Itu G418 Sulfat (Geneticin) produk harus disimpan pada suhu -15℃ ~ -25℃ untuk 3 bertahun-tahun.

Instruksi

1. Persiapan larutan penyimpanan G418 (50 mg/mL, konsentrasi aktif)

1) Konversi satuan aktivitas

Konversi dilakukan sesuai dengan rumus berikut: (1000/A0) ×A1=A2

A0: Nilai potensi G418, yang bervariasi dari satu batch ke batch lainnya. Lihat laporan kualitas batch atau label pada botol.

A1: Konsentrasi G418 aktif yang Anda inginkan.

A2: Konsentrasi G418 yang sebenarnya.

Misalnya, jika nilai aktivitas G418 dari batch adalah 750 U/mg dan konsentrasi aktif G418 adalah 50 mg/mL, konsentrasi bubuk aktual yang harus disiapkan adalah 1000/750×50 mg/mL=66,67 mg/mL. Jika 10 mL larutan penyimpanan G418 (konsentrasi aktif, 50 mg/mL) disiapkan, 666,7 mg bubuk harus ditimbang.

2) Sterilisasi dan pengawetan

Timbang bubuk sebenarnya yang diperoleh dari konversi di atas dan tambahkan 10 mL air deionisasi steril untuk melarutkannya sepenuhnya.

Basahi terlebih dahulu filter jarum 0,22 μm dengan 5 mL air deionisasi steril, lalu sterilkan larutan G418 dengan penyaringan.Ambil sebagian larutan G418 yang telah disterilkan dan simpan pada suhu -20℃.

Catatan: ① Jangan menyaring larutan yang keruh, karena larutan belum larut sempurna. Proses penyaringan akan menyebabkan hilangnya obat dan mengurangi aktivitas larutan akhir. ② Tidak disarankan untuk menggunakan media kultur, larutan fosfat, atau pelarut organik untuk menyiapkan larutan penyimpanan.

2. Konsentrasi penyaringan yang umum digunakan

Secara umum, konsentrasi tinggi G418 diperlukan pada awalnya untuk menyaring transformator dan menggunakan konsentrasi rendah untuk mempertahankan kultur. Kondisi pertumbuhan, jenis sel, dan faktor lingkungan lainnya dapat memengaruhi dosis efektif G418, sehingga disarankan untuk menentukan konsentrasi penyaringan optimal melalui kurva pembunuhan (kurva dosis-respons).

Secara umum, kisaran penyaringan sel mamalia adalah 200-2000 μg/mL, Sel tumbuhan: 10-100 μg/mL, Sel ragi: 500-1000 μg/mL.

Data Eksperimen Garis Sel

3. Pembentukan kurva pembunuhan

Catatan: Untuk menyaring lini sel dengan ekspresi protein target yang stabil, perlu untuk menentukan konsentrasi minimum antibiotik yang dapat membunuh sel inang yang tidak ditransfeksi. Hal ini dapat dicapai dengan membuat kurva pembunuhan (kurva dosis-respons). Setidaknya enam konsentrasi harus dipilih. G418 paling aktif saat mengobati sel mitosis, sehingga sel perlu dikultur selama beberapa waktu sebelum menambahkan G418.

1) Hari 1: Sel yang belum ditransformasi ditempatkan pada pelat kultur yang sesuai dengan kepadatan sel 20-25% pada suhu 37℃ dan dikultur semalaman dalam CO₂Bahasa Indonesia:

Catatan: Untuk sel yang membutuhkan kepadatan lebih tinggi untuk mendeteksi viabilitas, jumlah inokulasi dapat ditingkatkan.

2) Atur gradien konsentrasi G418 dalam rentang yang sesuai menurut jenis sel. Sel mamalia dapat diatur pada 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Hari ke-2: Buang media lama dan ganti dengan media baru yang telah disiapkan yang mengandung konsentrasi obat yang sesuai. Buat tiga tabung paralel untuk setiap konsentrasi.

4) Kemudian ganti dengan media baru yang mengandung G418 setiap 3-4 hari.

5) Penghitungan sel hidup dilakukan pada siklus tetap (misalnya, setiap 2 hari) untuk menentukan konsentrasi yang tepat. Pilih konsentrasi minimum, yang membunuh sebagian besar sel dalam jumlah hari yang ideal (biasanya 7-10 hari), sebagai konsentrasi kerja untuk penyaringan sel transfeksi yang stabil.

4. Penyaringan sel transfeksi yang stabil

1) 48 jam setelah transfeksi, media kultur G418 yang mengandung konsentrasi yang sesuai digunakan untuk subkultur (subkultur langsung atau subkultur encer).

Catatan: Untuk memperoleh hasil penyaringan yang baik, disarankan untuk mengencerkan sel tidak lebih dari 25% kelimpahannya.

2) Ganti media penyaringan yang berisi obat setiap 3-4 hari.

3) Ukur pembentukan koloni sel setelah 7 hari penyaringan. Pembentukan koloni mungkin memerlukan waktu seminggu atau lebih, tergantung pada jenis sel inang, transfeksi, dan efektivitas penyaringan.

4) 5-10 klon resistan dipilih dan dipindahkan ke pelat kultur sel berukuran 35 mm, lalu dikultur dengan media penyaringan yang mengandung obat selama 7 hari.

5) Ganti dengan media normal.

Dokumen:

Lembar Data Keselamatan

60220Dokumen Referensi _MSDS_HB220421_ID.pdf

Buku Panduan

60220Buku Panduan HB250115_ID.pdf

Angka

Gambar 1.Uji stabilitas dan validasi konsentrasi efektif genomycin antar batch yang berbeda

Strain percobaan: E. coli

G69 dan G99 adalah dua kelompok yang berbeda

Konsentrasi penggunaan genomycin ditetapkan sebesar 8 mg/L, 12 mg/L dan 16 mg/L, dan konsentrasi minimum efektif ditetapkan sebesar 16 mg/L, yang secara sempurna menghambat pertumbuhan bakteri lain-lain. Kinerja kedua kelompok tersebut konsisten.