Higromisin B, antibiotik aminoglikosida yang disintesis oleh Streptomyces hygroscopicus, menghambat sintesis protein dengan mengganggu translokasi ribosom 70S dan menyebabkan kesalahan pembacaan templat mRNA, sehingga membunuh prokariota (seperti bakteri), eukariota (seperti ragi, jamur) dan eukariota mamalia tingkat tinggi.

Gen resistensi higromisin (hyg atau hph) yang berasal dari Escherichia coli mengkode fosfotransferase higromisin B, yang mendetoksifikasi higromisin B menjadi produk terfosforilasi yang tidak aktif secara biologis, menjadikannya penanda selektif yang sangat baik untuk skrining dan kultur sel prokariotik atau eukariotik yang berhasil ditransfeksi dengan gen resistensi higromisin. Selain itu, karena cara kerja yang berbeda, higromisin B sering digunakan dalam kombinasi dengan G418 atau Blastisidin S untuk pemilihan lini sel yang resistan ganda. Higromisin B juga dapat digunakan sebagai agen antivirus karena secara selektif menembus ke dalam sel dengan permeabilitas membran yang meningkat karena infeksi virus dan menghambat translasi. Ia juga dapat bertindak sebagai pengusir serangga melalui campuran dengan pakan ternak.

Produk ini adalah larutan higromisin B steril (50 mg/mL dalam penyangga PBS) dan dapat langsung diencerkan untuk digunakan dengan media kultur.

Fitur

Produksi standar, menggunakan mode produksi massal pabrik

Aplikasi

Steril

Penyaringan garis sel yang ditransfeksi secara stabil

Spesifikasi

Komponen

Pengiriman dan Penyimpanan

Itu Higromisin B (50 mg/mL) Produk harus disimpan di 2℃ ~ 8℃ untuk 2 bertahun-tahun.

Instruksi

1. Konsentrasi penyaringan yang umum digunakan

Konsentrasi kerja higromisin B yang digunakan untuk menyaring strain transfer yang stabil perlu bervariasi tergantung pada jenis sel, media, kondisi pertumbuhan dan laju metabolisme sel, dengan konsentrasi yang direkomendasikan 50-1000 akug/mL. Untuk sistem percobaan pertama, kurva pembunuhan (kill curve), kurva reaktivitas dosis, direkomendasikan untuk menentukan konsentrasi penyaringan yang optimal.

Secara umum sel mamalia: 50-500 akug/mL; Sel bakteri/tanaman: 20-200 akug/mL; Jamur: 300-1000 akuSatuan unit pengukuran:

2. Pembentukan kurva pembunuhan

Catatan: Untuk menyaring lini sel yang stabil, perlu untuk menentukan konsentrasi minimum antibiotik yang mampu membunuh sel inang yang tidak ditransfeksi. Hal ini dapat dicapai dengan membuat kurva pembunuhan (kurva dosis-respons). Setidaknya lima konsentrasi harus diatur.

1) Hari ke-1: Sel-sel yang belum ditransformasi diletakkan pada pelat kultur yang sesuai dengan kepadatan sel 20-25% dan dikulturkan semalaman.

Catatan: Jumlah sel inokulasi dapat ditingkatkan untuk sel yang membutuhkan kepadatan lebih tinggi untuk mendeteksi vitalitas.

2) Atur gradien konsentrasi dalam rentang yang sesuai menurut jenis sel. Sel mamalia dapat mengatur 50, 100, 250, 500, 750, 1000 akug/mL. Encerkan larutan Hygromycin B dengan perbandingan 1:10 dengan air deionisasi atau buffer PBS hingga 5 mg/mL. Kemudian encerkan larutan hingga mencapai konsentrasi kerja yang sesuai menurut tabel berikut.

3) Hari ke-2: Ganti dengan media yang baru disiapkan yang mengandung konsentrasi obat yang sesuai. Buat tiga sampel paralel untuk setiap konsentrasi.

4) Kemudian ganti dengan media baru yang mengandung obat setiap 3-4 hari.

5) Lakukan penghitungan sel hidup pada interval tertentu (misalnya setiap 2 hari) untuk menentukan konsentrasi yang tepat yang menghambat pertumbuhan sel yang tidak ditransfeksi. Pilih konsentrasi terendah yang dapat membunuh sebagian besar sel dalam jumlah hari yang ideal (biasanya 7-10 hari) sebagai konsentrasi kerja untuk pemilihan transfektan yang stabil.

3. Penyaringan Garis Sel Mamalia yang Ditransfeksi Secara Stabil

1) 48 jam setelah transfeksi, sel disubkultur dengan media penyaringan yang mengandung higromisin B pada konsentrasi yang sesuai (langsung atau diencerkan).

Catatan: Antibiotik bekerja paling baik pada sel yang sedang membelah secara aktif. Jika sel terlalu padat, antibiotik tidak akan membunuh sel tersebut. Pisahkan sel sedemikian rupa sehingga sel-sel tidak lebih dari 25% menyatu.

2) Ganti media penyaringan setiap 3-4 hari.

3) Ukur pembentukan koloni sel setelah 7 hari penyaringan. Pembentukan koloni mungkin memerlukan waktu seminggu atau lebih, tergantung pada jenis sel inang, transfeksi, dan efektivitas penyaringan.

4) Pilih 5-10 klon yang resistan dan pindahkan ke pelat kultur sel berukuran 35 mm, lalu kulturkan dengan media penyaringan yang mengandung obat selama 7 hari.

5) Ganti dengan media baru tanpa obat untuk kultur.

Dokumen:

Lembar Data Keselamatan

60224Dokumen Referensi _MSDS_HB22042angka 0_ID.pdf

Buku Panduan

60224Buku Panduan HB250115_ID.pdf